“紅陽”獼猴桃果實低溫貯藏期糖代謝分析

賈德翠，卜范文，蔣娟瓊，涂洪強，彭書明，陳 環(huán)，馬幸幸，王元順

（1. 湘西自治州農(nóng)業(yè)科學研究院，湖南 吉首 416000；2. 湖南省園藝研究所，湖南 長沙 410125；3. 吉首市鄉(xiāng)村振興局，湖南 吉首 416000）

獼猴桃（Actinidia chinensis）也稱奇異果，是一種多年生的藤本植物[1]，果實清香味美、甘甜可口，富有豐富維生素C、可溶性纖維、多種微量元素和礦物質(zhì)元素等[2-3]，具有較高的食用價值和一定的保健效果，尤其是在降血壓血脂、降膽固醇、生津潤燥、美容養(yǎng)顏、安神益智等方面具有較好的作用[4-5]，素來備受廣大消費者的喜愛[6]。我國是獼猴桃的原產(chǎn)國，種植面積和產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一，是我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要果樹之一[7]。但果實不耐貯藏影響了其產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，尤其是中華系列的紅肉獼猴桃耐貯性效果更差，因此探討果實軟化的機理具有重要的意義[8]。據(jù)相關(guān)研究表明果實硬度的下降與多糖分解酶的活性及相關(guān)酶基因的表達有關(guān)，羅靜等[9]研究獼猴桃常溫貯藏時發(fā)現(xiàn)，各個果膠酶基因在2～8 d 時間段會出現(xiàn)高峰值，一周后果實快速軟化，另外果實經(jīng)乙烯誘導后果膠酶基因的表達會有很大程度的提高，導致果實硬度提前快速降低。陳景丹等[10]測定了常溫貯藏不同時間段獼猴桃淀粉酶基因的表達，同樣發(fā)現(xiàn)各淀粉酶基因在2～8 d 時間段會出現(xiàn)高峰值，一周后果實快速軟化，當果實采用1-MCP 處理后果實淀粉酶基因表達量會有所降低，果實硬度下降會有所延緩。賈德翠等[11]對獼猴桃進行低溫貯藏，發(fā)現(xiàn)獼猴桃果膠酶和淀粉酶等多糖分解酶的活性在30 d 左右會出現(xiàn)峰值，在50 d 左右酶活性開始快速降低，當果實采用肉桂提取物處理后可較大程度降低酶活性，延緩果實的軟化。目前有關(guān)獼猴桃貯藏期硬度方面的研究主要集中在常溫條件下某一種基因表達對其硬度的影響，或相關(guān)多糖分解酶活性變化對其硬度的影響，而對于獼猴桃采后低溫貯藏成熟期間，果實硬度與相應酶基因表達和酶活性之間的關(guān)系的研究還未曾報道。為此，筆者以不耐貯藏的紅陽獼猴桃為試驗材料，探索果實在低溫條件下軟化的主要機理，以期為進一步闡明獼猴桃采后多糖分解酶基因表達及其酶活性與果實成熟軟化進程之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以六年生至八年生紅陽獼猴桃植株的果實為試材，果實于2019 年9 月中旬采自湖南永順獼猴桃基地。18：00—19：00 采摘，采摘后立刻放入經(jīng)冰袋預冷的泡沫箱中，連夜運回實驗室在溫度（4±1）℃、空氣相對濕度90%的條件下冷藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 貯藏期間果實生理指標測定挑選果實大小均一、無機械損傷、無病蟲害及成熟度一致的果實進行有機酸（酸堿滴定法測定[12]）、還原糖（硫酸苯酚顯色法測定[13]）、可溶性固形物（手持可固分析儀測定）和果實硬度（GY-3 果實硬度計）的測定，每15 d 測定一次，每次測定分別隨機取5～8 個果實果肉混勻，每次測定3 個重復。

1.2.2 貯藏期間果實多糖分解酶活性測定纖維素酶、β-1,3 葡聚糖酶活性采用試劑盒（索萊寶生物科技有限公司）測定，淀粉酶活性、果膠酶（PG）活性參考曾鄒林等[14]的方法測定。每15 d 測定一次，每次測定分別隨機取5～8 個果實果肉混勻，每次測定3 個重復。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析采用Trizol 試劑盒提取獼猴桃果實的RNA。RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA 為模板進行PCR 擴增，引物序列如表1 所示，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。反應體系：1 μL 上游引物（10 nmol/L），1 μL 下游引物（10 nmol/L），10 μL SYBR Green qPCR SuperMix，1 μL模板，滅菌后的雙重蒸餾水補充至20 μL。反應條件：95℃條件下預變性10 min；95℃條件下變性10 s，60℃條件下退火30 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40 次。以Actin作為內(nèi)參，參照陳義挺等[15]的方法，采用相對定量2-ΔΔCt 分析法（CT 值比較法）計算樣品中各基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析，采用Origin 2019 軟件進行制圖，采用Statistix 8.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有指標數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差（mean±SD）表示，并用最小顯著極差法（LSD）對數(shù)據(jù)進行顯著性差異檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中獼猴桃果實生理指標的變化

由圖1 可知，隨著貯藏期的延長，果實硬度和可滴定酸值逐漸下降。貯藏45 d 時，硬度由初始的15.03 kg/cm2下降到9.36 kg/cm2，此時果實已經(jīng)較為軟化；可滴定酸由初始的1.52%下降到0.76%。而果實還原糖及可溶性固形物的含量隨著貯藏期的延長呈逐漸增加的趨勢，果實剛采摘時可溶性固形物和還原糖含量均較低，分別僅有6.8%和4.3%，當果實貯藏45 d 時可溶性固形物和還原糖含量分別高達16.8%和9.9%，此時果實的糖酸比和固酸比分別達到了22.11和13.05，果實口感已有較大的提升。另外，從圖1中還可以看出，貯藏前后4 個指標的差異均達極顯著水平（P＜0.01）

圖1 不同貯藏時期果實的生理指標

2.2 貯藏過程中獼猴桃果實多糖酶活性的變化

由圖2 可知，4 種多糖分解酶活性均表現(xiàn)出了“較高—高—低”的變化趨勢，且貯藏45 d 后酶活性均低于剛采摘時。果膠酶和葡聚糖酶活性在貯藏30 d 時出現(xiàn)了最大值，分別達到了8.09 mg/(min·g)和26.01 U/g，在貯藏45 d 時便急劇下降，分別僅為4.86 mg/(min·g)和7.88 U/g。淀粉酶和纖維素酶活性貯藏15 d 時出現(xiàn)了最大值，分別達到了1.06 mg/(min·g)和114.32 U/g，同樣貯藏45 d 時便急劇下降，分別僅為0.63 mg/(min·g)和36.74 U/g.4 種酶活性的峰值與貯藏45 d 時的數(shù)值均有極顯著差異。這體現(xiàn)了果實貯藏過程中多糖分解酶活性由初始的較高到后來的高再到最后急劇下降的變化規(guī)律。

圖2 不同貯藏時期果實的多糖酶活性

2.3 貯藏過程中獼猴桃果實多糖酶基因表達的變化

由圖3 可知，4 種多糖分解酶基因在貯藏15～30 d 時均表現(xiàn)出了較高的表達量。例如果膠酶基因Achn305411 和Achn293521 在貯藏30 d 時相對表達量分別高達1.77 和2.89，但貯藏45 d 時果膠酶基因的表達量急劇下降，僅在0.1～0.2 之間；淀粉酶基因Achn072001 和Achn273151 在貯藏15 d 時相對表達量分別高達2.44 和1.66 貯藏30 d 時表達量略微降低，但貯藏45 d 時則下降明顯，僅有0.3～0.5 之間；與淀粉酶基因一樣，纖維素酶基因Achn189731和Achn294591 在貯藏15 d 時相對表達量分別高達3.71 和2.33，貯藏30 d 時表達量略微降低，貯藏45 d 時下降明顯，僅有0.2～0.4 之間；葡聚糖酶基因Achn058881 和Achn171941 在貯藏30 d 時相對表達量分別高達2.57 和4.62，貯藏45 d 時下降明顯，僅有0.2～0.5 之間。總體上各個基因在貯藏15～30 d 時表達量較初始階段有較大程度地提高（P＜0.01），但貯藏至45 d 時便急劇下降（P＜0.01），說明此時果實已經(jīng)開始進入快速衰老期，這與前文提到的果實中各種酶活性的變化趨勢基本一致。

圖3 不同貯藏時期果實多糖分解酶基因的相對表達量

2.4 貯藏過程中獼猴桃果實糖代謝指標主成分分析

2.4.1 主成分個數(shù)確定由表2 可知，10 個糖代謝指標共得到2 個主成分，主成分1 特征值為7.07，貢獻率為70.70%；主成分2 特征值為2.69，貢獻率為26.96%。2 個主成分的累積貢獻率為97.66%，已經(jīng)包含了原有10 個指標的全部信息。第1 主成分主要凸顯指標由“高—低”的變化趨勢，在相應成分矩陣中可溶性固形物、還原糖、固酸比、糖酸比為負值，在主成分分析圖（圖4）的左側(cè)，說明它們與第一主成分的相關(guān)性非常小，因為它們主要凸顯指標由“低—高—低”的變化趨勢。第2 主成分主要凸顯理化指標由“較高—高—低”以及“低—高—低”的變化趨勢，其中4 個酶是較大的正值，說明它們于第2 成分相關(guān)性非常大，可滴定酸和硬度是負值，在主成分分析圖（圖4）的下側(cè)，說明它們與第2 成分相關(guān)性非常小。圖4 中A 的位置表示，果實剛采摘時與第一主成分正相關(guān)，與第二在主成分負相關(guān)，B/C/D 以此類推，這與表3 中f1、f2值的正負關(guān)系一致。

表2 各指標載荷矩陣和特征向量

圖4 主成分分析圖

2.4.2 主成分綜合模型構(gòu)建由表2 獲得第1 主成分、第2 主成分的模型f1、f2，再選取的第1、第2 主成分的方差貢獻率a1、a2為權(quán)數(shù)，構(gòu)建綜合評價模型：

由表3 可知，f1主要表現(xiàn)由高到低變化趨勢的理化指標，果實在貯藏30 d 時，開始顯著性降低；f2主要表現(xiàn)由“低—高—低”變化趨勢的理化指標，果實在貯藏45 d 時，開始顯著性降低。F 值是對2 個主成分的總結(jié)性歸納，F(xiàn) 值在貯藏45 d 時開始出現(xiàn)負值，說明此時果實已經(jīng)進入快速軟化后熟期。

表3 果實理化指標標準化值與綜合得分

3 討論與結(jié)論

獼猴桃貯藏期間果實硬度的降低、還原糖和可溶性固形物的增加主要是由于多糖類物質(zhì)、大分子蛋白等物質(zhì)的分解所造成的[16-17]，一般低溫貯藏可延緩這些物質(zhì)的分解，其主要原因是低溫可有效降低果實的呼吸作用強度從而減少糖類物質(zhì)的分解與消耗，降低乙烯的釋放量，同時抑制果實體內(nèi)大分子物質(zhì)分解酶的活性和相關(guān)酶基因的表達等[18]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，獼猴桃果實在（4±1）℃條件下貯藏45 d 時，果實的可溶性固形物和還原糖含量較剛采摘時雖有較大程度的升高，但此時果實的硬度仍有9.36 kg/cm2，說明果實還未完全軟化。果實體內(nèi)果膠酶、淀粉酶、纖維素酶和葡聚糖酶在貯藏15～35 d 時出現(xiàn)酶活性最大值，說明此時果實正處于快速軟化的前期階段，貯藏45 d 時果實酶活性大幅度降低，可能是此時酶基因表達有所下降所致[19-20]。陳金印等[21]發(fā)現(xiàn)在低溫條件下，獼猴桃淀粉酶活性在果實貯藏30 d 時出現(xiàn)峰值，果膠酶活性在貯藏30～60 d 時出現(xiàn)峰值，因此，在貯藏30 d左右果實的淀粉、果膠含量及硬度開始快速降低。果實貯藏期果膠酶、淀粉酶、纖維素酶和葡聚糖酶基因表達強弱與對應的酶活性大小所呈現(xiàn)的規(guī)律基本一致，同樣也是在貯藏15～35 d 時出現(xiàn)基因表達高峰，45 d 時表達量急劇下降。獼猴桃果實在貯藏45 d 時出現(xiàn)酶活性降低、相關(guān)酶基因表達量下降以及果實理化指標綜合評價值（F 值）負值的情況均表明果實開始走向衰老，但不意味著果實的腐敗變質(zhì)。據(jù)報道，果膠酶在果實成熟前期對果實的軟化基本不起作用，在果實成熟中后期對果實軟化作用明顯[22]，因此預計在貯藏45～60 d 這段時間可出現(xiàn)還原糖和可溶性固形物的最大值，在60～80 d 時果實還原糖會由于果實自身的呼吸作用而逐漸降低。預計在第80 天后果實開始逐漸出現(xiàn)腐爛變質(zhì)的情況。果實貯藏期是否能夠得到有效的延長主要看能否在果實貯藏初期的30 d 內(nèi)有效降低果實體內(nèi)相關(guān)酶基因的表達，并控制果實體內(nèi)的相關(guān)生理活性，這段時間是導致果實軟化的關(guān)鍵期，在今后的研究中可進行除低溫外的其他復合藥劑處理，以進一步抑制果實在此段時間的多糖代謝活性。