九味楮實顆粒對SD雌鼠中樞性性早熟的體質量及性激素水平的影響

黃艷霞 劉建忠 張雪榮

〔摘要〕 目的 應用N-甲基-DL-天冬氨酸（NMA）構建SD雌性大鼠中樞性性早熟模型，并探討九味楮實顆粒對雌性真性性早熟大鼠體質量及垂體分泌的卵泡刺激素（follicule-stimulating hormone， FSH）、促黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、雌二醇（estradiol， E2）水平的影響。方法 選取48只26日齡SD雌鼠隨機分對照組、模型組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組8只。除對照組外，其余組均采用NMA方法建立性早熟動物模型，中藥組、西藥組分別予九味楮實顆粒、戈那瑞林干預，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水干預，每日觀察陰道口開放情況，每間隔2 d測一次體質量，計算各組大鼠臟器系數（子宮、卵巢及雙側乳腺），采用ELISA檢測血清FSH、LH、E2水平。結果 與對照組比較，模型組大鼠陰道口開放時間提前（P<0.05）;大鼠在出生后26、29、32 d體質量無明顯變化（P>0.05）;子宮系數升高（P<0.05）;血清LH、FSH水平明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，西藥組、中藥各劑量組大鼠陰道口開放時間明顯延遲（P<0.05）;中藥高劑量組大鼠在出生后35、38 d體質量明顯降低（P<0.05）;西藥組、中藥中劑量組大鼠子宮系數降低（P<0.05）;西藥組、中藥中劑量組大鼠卵巢系數及雙側乳腺系數無明顯變化（P>0.05）;西藥組、中藥高劑量組、中劑量組的血清LH、FSH、E2水平明顯降低（P<0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥高中劑量組的血清LH、FSH、E2水平明顯降低（P<0.05）。結論 九味楮實顆粒可抑制NMA誘發雌鼠性早熟的發生，同時能降低性早熟模型大鼠的血清LH、FSH、E2的水平，推測九味楮實顆粒可能通過調節下丘腦-垂體-性腺軸起到抑制性早熟的作用。

〔關鍵詞〕 性早熟;九味楮實顆粒;N-甲基-DL-天冬氨酸;體質量;性激素;大鼠

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.010

Effect of Jiuwei Chushi Granule on Body Mass and Sex Hormone Levels of Central

Precocious Puberty in SD Female Rats

HUANG Yanxia1， LIU Jianzhong1，2*， ZHANG Xuerong1，2

（1. Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China; 2. The Affiliated Hospital of Hubei

University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430061， China）

〔Abstract〕 Objective To construct a SD female rat model of central precocious puberty with N-methyl-DL-aspartate （NMA）， and to explore the effect of Jiuwei Chushi Granule on the body mass and the levels of follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and estradiol （E2） secreted by pituitary gland. Methods 48 female SD rats at 26 days of age were randomly divided into control group， model group， western medicine group， high dose Chinese medicine group， medium dose Chinese medicine group and low dose Chinese medicine group， with 8 rats in each group. Except for the control group， the animal model of precocious puberty was established by NMA method in other groups. The Chinese medicine group and western medicine group were given Jiuwei Chushi Granule and gonadorelin intervention respectively. The control group and model group were given equal volume of normal saline intervention. The vaginal opening was observed daily， and the body weight was measured every two days. Organ coefficients （uterus， ovary and bilateral mammary gland） were calculated， and serum FSH， LH and E2 levels were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the vaginal opening time of model group was earlier （P<0.05）; uterine coefficient increased （P<0.05）; serum LH and FSH levels were significantly increased （P<0.05）; there was no significant change in body weight of rats on day 26， 29 and 32 after birth （P>0.05）. Compared with model group， the opening time of vaginal opening in western medicine group and Chinese medicine groups was significantly delayed （P<0.05）; the body weight of rats in high dose Chinese medicine group was significantly decreased at 35 and 38 days after birth （P<0.05）; uterine coefficient of western medicine group and medium dose Chinese medicine group decreased （P<0.05）; there were no significant changes in ovarian coefficient and bilateral mammary gland coefficient in western medicine group and medium dose Chinese medicine group （P>0.05）; serum LH， FSH and E2 levels in western medicine group， high dose Chinese medicine group and medium dose Chinese medicine group were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the low dose Chinese medicine group， the levels of LH， FSH and E2 in the high dose Chinese medicine group and medium dose Chinese medicine group were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Jiuwei Chushi Granule can inhibit NMA induced precocious puberty in female rats and reduce the levels of serum LH， FSH， E2 in precocious rats. Jiuwei Chushi Granule may inhibit precocious puberty by regulating hypothalamus-pituitary-gonadal axis.

〔Keywords〕? precocious puberty; Jiuwei Chushi Granule; N-methyl-DL-aspartate; body mass; sex hormone; rat

性早熟[1]是指女孩在8歲之前、男孩在9歲之前出現性發育征象，是由GnRH神經元的過早激活引起的[2]，是小兒常見的內分泌疾病之一。根據下丘腦-垂體-性腺軸功能啟動與否，又分為真性性早熟和假性性早熟，而真性性早熟以中樞性性早熟最常見[1]。據報道全球性早熟發病率約為0.2%，女孩是男孩的5～10倍，性早熟已成為全球關注的熱點問題，若性早熟患兒得不到及時正確治療，會引起骨骺端提前閉合，致終身高矮小及一系列心理行為問題[3]。目前，治療性早熟常用的西藥為促性腺激素釋放激素類似物，但其價格昂貴，長期使用會給患兒家庭帶來沉重經濟負擔，而諸多文獻[4-7]證明中醫藥治療性早熟已取得良好效果。為了觀察九味楮實顆粒對性早熟的干預作用及機制，本實驗以N-甲基-DL-天冬氨酸（NMA）構建雌性大鼠真性性早熟模型，采用中藥高、中、低劑量分別進行干預，通過測定血清促黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、卵泡刺激素（follicule-stimulating hormone， FSH）、雌二醇（estradiol， E2）水平的變化探討九味楮實顆粒的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1? 主要藥物

九味楮實顆粒為湖北省中醫院兒科生長發育專科協定方，依照與九味楮實顆粒處方相同的原料及制備工藝方式提取，并將其濃縮為每毫升浸膏含1.98 g生藥劑型，中藥飲片由湖北省中醫院藥劑科提供，藥材來源于湖北辰美中藥有限公司，按兒童臨床用量3.33 g/kg將浸膏用蒸餾水混勻，根據等效劑量換算公式折算成大鼠劑量。NMA（批號：116H5840，Aladdin公司）;注射用戈那瑞林（規格100 μg/kg，批號：200108-2，馬鞍山豐原制藥有限公司）。

1.2? 動物

大鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，生產許可證號SCXK（鄂）2015-0018。在湖北中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房飼養，室溫20～26 ℃，每日光照時間06：00～18：00，濕度60%～70%，喂養普通顆粒飼料（由湖北中醫藥大學實驗動物中心提供），所有提供的食物和水均是無菌的，自由進食飲水，每兩日更換一次墊料。實驗動物的操作均符合湖北中醫藥大學實驗動物倫理學管理條例。

1.3? 主要儀器與試劑

FA2004C型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）;TG16W型微量高速離心機（鞏義市予華儀器有限責任公司）;GNP-9080型隔水式恒溫培養箱（北京六一儀器有限公司）;DM1000正置顯微鏡（徠卡顯微系統有限公司）;AMR-100酶標分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）;APW-200型酶標洗板機（杭州奧盛儀器有限公司）;48T ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：GR2020-10），其中包括E2試劑（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：JYM0608Ra）;FSH試劑（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：JYM0597Ra）;LH試劑（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：JYM0623Ra）;0.1%呂氏堿性美蘭染液（北京索萊寶科技有限公司）;瑞氏-姬姆薩A染色液（湖南常德比克曼生物科技有限公司）;磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）B液（湖南常德比克曼生物科技有限公司）。

1.4? 造模方法

自26日齡起至陰道口開放之日，對照組皮下注射生理鹽水0.2 mL/次，2次/d;其余各組每日14：00和16：00皮下注射NMA 40 mg/kg，每日觀察各組大鼠陰道口開放情況，當大鼠陰道口開放后視為造模成功。

1.5? 動物分組與處理

選出5 d內出生的雌仔鼠，分為6籠，每籠8只，由親母喂養，22日齡斷奶，并與母鼠分籠。適應性喂養4 d后，選用SPF級體質量在（46.49±8.00） g的26日齡SD雌鼠48只，完全隨機分為6組：對照組、模型組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組8只，對照組、模型組每日09：00予生理鹽水灌胃1 mL，西藥組予戈那瑞林皮下注射100 μg/kg，中藥高、中、低劑量組分別予以九味楮實顆粒69.48、34.74、17.37 g/kg灌胃，均為1次/d。對于陰道口已開放的大鼠，每日08：00進行陰道細胞涂片觀察其性周期變化。陰道涂片（自制棉簽法[8]）即用細的牙簽制成的棉簽放入生理鹽水浸濕，并輕插入大鼠陰道內0.5～

1 cm，順牙簽纏繞方向旋轉1～2圈后取出，由中心向四周均勻涂于載玻片上，待載玻片自然干燥后，分別同時采用美蘭及瑞氏[9]兩種染色方法，低倍光鏡下觀察其細胞形態以確定大鼠性周期各個階段[10]。當模型組大鼠出現第一個發情前期時停止給藥，其他各組同時停止藥物干預，且停止給藥的動物數要與模型組的動物數相等。

1.6? 標本采集與制備

當模型組大鼠出現第一個發情前期時當日稱量體質量后處死，其他各組按1∶1比例同時處死，用0.3 mL/100 g的10%水合氯醛麻醉后腹主動脈采血，取血清，-20 ℃凍存，留取標本（第2對乳腺、雙側卵巢和子宮），稱量第2對乳腺、卵巢和子宮濕重。

1.7? 指標測定

1.7.1? 測量各組大鼠體質量? 自造模之日起，每間隔2 d按照固定的時間點（上午7時）用SOVO索沃電子秤測量各組大鼠體質量，保留兩位小數，直至實驗結束。

1.7.2? 計算各組大鼠臟器系數? 對各組大鼠進行麻醉處理后，頸椎脫臼法處死，取大鼠卵巢、子宮、雙側乳腺組織，用電子天平稱量卵巢、子宮、雙側乳腺濕重，根據器官系數=器官濕重（g）/體質量（g），計算臟器系數。

1.7.3? 測量各組大鼠血清LH、FSH、E2的水平? 取各組大鼠麻醉處死前腹主動脈采血3 mL，利用離心機3 000 r/min處理15 min后分離上清液，在-20 ℃環境中保存待檢。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行，包括標準品的稀釋、加樣、加酶及溫育、洗滌、顯色、終止反應、測吸光度（OD值），按照步驟測量血清LH、FSH、E2的含量。

1.8? 統計學分析

所有數據采用SPSS 25.0軟件處理，數據以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義;采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結果

2.1? 各組大鼠陰道口開放情況

與對照組比較，模型組大鼠陰道口開放時間提前（P<0.05）;與模型組比較，中藥各劑量組及西藥組出現陰道口開放時間明顯延遲（P<0.05）。見圖1。

2.2? 大鼠動情周期陰道細胞涂片染色情況

大鼠陰道細胞涂片采用堿性美蘭染色法，如圖2所示，動情間期（M1期）以大量白細胞為主;動情前期（M2期）以有核上皮細胞為主，有少量無核角化上皮細胞;動情期（M3期）幾乎全是片狀的無核角質化細胞;動情后期（M4期）以白細胞、角化細胞、有核細胞3種細胞并見，以大量白細胞為主。大鼠陰道口開放當日陰道涂片結果為動情期，SD雌鼠動情周期平均為4～5 d，動情期一般持續1～2 d，連續出現有規律的動情周期。

2.3? 各組大鼠不同日齡體質量的變化

與對照組比較，模型組大鼠在出生后26、29、32 d體質量差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組比較，中藥高劑量組大鼠體質量降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.4? 各組大鼠不同臟器系數比較

與對照組比較，模型組大鼠子宮系數升高（P<0.05）;卵巢系數及雙側乳腺系數變化不明顯（P>0.05）。與模型組比較，西藥組、中藥中劑量組大鼠子宮系數降低（P<0.05）;西藥組、中藥各劑量組大鼠卵巢系數及雙側乳腺系數無顯著差異（P>0.05）。見表2。

2.5? 各組大鼠性激素LH、FSH、E2水平比較

與對照組比較，模型組大鼠LH、FSH水平升高（P<0.05），E2水平降低（P<0.05）。與模型組比較，西藥組及中藥高、中劑量組大鼠LH、FSH、E2水平降低（P<0.05）;與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組、中藥中劑量組血清LH、FSH、E2降低（P<0.05）。見表3。

3 討論

中國古代醫學典籍中并無性早熟這個病名，中醫病名同現代病名一致。兒童性早熟是由先天及后天因素共同影響的結果[11]，小兒臟腑嬌嫩，形體未充，肝常有余，腎常不足，其病機主要責之于腎陰陽失衡，腎陰不足，累及肝陰，相火偏旺。文獻研究[12]發現性早熟的證型大致可以分為肝腎陰虛、肝郁化火型、脾胃濕熱型三大類，臨床上常以陰虛火旺型為主癥，以“滋陰補腎、清瀉相火”為治法，其中性早熟的代表方中，以知柏地黃丸[13]及丹梔逍遙丸[14]最為常用。九味楮實方由“知柏地黃丸”合“柴胡疏肝散”加減化裁而來，具體成分為楮實子、醋柴胡、生地黃、知母、黃柏、郁金、荔枝核、貓爪草、白芍。方中以性寒之楮實子、甘苦之生地黃為君藥，滋腎陰清肝;以苦甘寒之知母、苦寒之黃柏、苦微寒之醋柴胡、苦微寒之白芍為臣藥，輔君滋陰降火，兼疏肝解郁;另以苦溫之荔枝核，甘溫之貓爪草，同歸肝經，兩者均可理氣化痰散結，消乳核，共為佐藥;以辛苦寒之郁金，芳香宣達，歸肝膽心肺經，行氣解郁，疏肝散結為使藥，諸藥合用攻補兼施，寒溫得益，共奏滋陰降火、平調肝腎、疏肝解郁、消腫散結之效，標本同治。該方為湖北省中醫院劉建忠主任醫師帶領的生長發育專科團隊經過5年余的臨床實踐總結的經驗方[15]，而九味楮實顆粒是在九味楮實方基礎上經過加工工藝正在申請的一個院內制劑，兩者組方相同。在前期臨床研究[16]中，我們發現運用九味楮實方配方顆粒口服治療女童中樞性性早熟，可以改善患兒乳腺發育、陰道分泌物增多等臨床癥狀，抑制患兒子宮、卵巢、卵泡發育，降低患兒血清LH、FSH、E2水平，臨床療效顯著，本次實驗研究以臨床使用有效劑量作為九味楮實顆粒中劑量組。

NMA屬于中樞神經系統中重要的一種興奮性神經遞質，使出生后26～29日齡的雌鼠陰門提前開啟，出現性周期，進入青春期[17]。有研究[18]發現，性早熟可能由于興奮性氨基酸受體激動劑激活下丘腦GnRH神經元，促進GnRH分泌增加，從而發揮中樞作用。故本研究采用NMA構建大鼠真性性早熟模型。本研究發現，與對照組比較，模型組大鼠陰道口提前開放;與模型組比較，中藥各組及西藥組出現陰道口開放時間明顯延遲，且中藥高、中劑量組較中藥低劑量組陰道口開放時間延遲，表明九味楮實顆粒可抑制EAAs受體激動劑NMDA誘導的雌性大鼠真性性早熟的發生。

引起性早熟的因素錯綜復雜，其中肥胖是導致性早熟的危險因素之一，有研究[19]顯示肥胖者體內脂肪組織可以分泌瘦素、脂聯素等生物活性因子，可能通過影響維生素D和黃體生成素的水平參與特發性性早熟的發生，而瘦素可以調節脂肪存儲量，通過下丘腦-垂體-性腺軸調節青春期啟動和生殖功能，促進垂體分泌LH和FSH，促進性腺分泌性激素，從而導致青春期提前發作。本研究結果表明，與對照組比較，各干預組大鼠在出生后26、29、32 d體質量差異無統計學意義（P>0.05），后期還需進一步探究早熟大鼠的體質量與性早熟之間是否存在聯系。

SD大鼠未發育之前，HPG未啟動，體內的LH、FSH、E2含量均較低，當大鼠性腺功能啟動時，垂體前葉分泌的LH、FSH大量增加，作用于性腺組織，增加E2的分泌，促進性腺的發育。黃體生成素是腺垂體嗜堿性粒細胞分泌的一種促性腺激素，一般由垂體分泌，可與卵泡刺激素協同作用于卵巢，促進排卵。臨床研究[20]證實兒童血清LH水平的顯著升高是其下丘腦-垂體-性腺軸活動被激活的重要指標。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組各組大鼠LH、FSH水平上升（P<0.05），與模型組比較，西藥組、中藥各組大鼠LH、FSH、E2水平均下降（P<0.05），說明九味楮實顆粒可降低性早熟大鼠血清LH、FSH、E2的水平;與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組、中藥中劑量組血清LH、FSH、E2水平下降（P<0.05），說明九味楮實顆粒在調節性早熟大鼠性激素LH、FSH、E2水平上存在量效關系。

乳腺發育主要受下丘腦-垂體神經內分泌系統調控，乳腺發育一般為雌激素刺激乳腺組織所致，在解剖上認為大鼠的第2對乳腺組織與人類乳腺較為接近[21-22]。子宮、卵巢為SD雌鼠的性腺組織，卵巢為性激素分泌的器官來源，而子宮則是性激素作用的靶器官。本研究結果顯示，與模型組比較，西藥組、中藥中劑量組子宮系數降低（P<0.05），說明九味楮實顆粒中劑量在一定程度上可以抑制子宮提前發育;與模型組比較，西藥組、中藥高中低劑量組卵巢系數及雙側乳腺系數無顯著差異（P>0.05），表明九味楮實顆粒對卵巢及雙側乳腺組織作用不顯著，后期還需從乳腺病理切片及多次實驗予以驗證。

綜合上述實驗結果推測，九味楮實顆粒可能是通過抑制下丘腦-垂體-性腺軸的啟動而起到抑制性早熟作用。后期實驗研究可以從肝腎功能、基因分子表達方面進一步探索九味楮實顆粒治療性早熟的具體作用機制，為進一步申請院內制劑及該藥投入臨床應用提供實驗依據。

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