艾灸對慢性萎縮性胃炎大鼠局部穴區組織代謝的影響

劉倩 尹鴻智 金佳燕 鐘歡 石佳 常小榮 劉密

〔摘要〕 目的 采用核磁共振氫譜技術（1H nuclear magnetic resonance， 1H-NMR）觀察艾灸對慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）大鼠局部穴區組織代謝的影響，從代謝的角度探究艾灸治療CAG可能的作用靶點和相關代謝路徑。方法 運用隨機數字表法將42只SD大鼠分為3組（正常組、模型組和治療組），每組14只。通過N甲基-N'-硝基-N亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG）聯合法制備CAG模型，造模成功后，正常組和模型組做抓取、捆綁處理，治療組予以艾灸足三里、中脘干預。治療14 d后，運用HE染色法觀察胃組織病理學變化，運用1H-NMR技術檢測足三里局部穴區組織代謝物，以Chenomx NMR Suite軟件分析所得數據。結果 HE染色下，模型組大鼠胃組織光鏡下可見固有腺體萎縮、結構紊亂且數量減少，符合CAG病理診斷標準;治療組大鼠胃組織有一定程度的改善。代謝物分析，與正常組相比，模型組中谷氨酰胺、琥珀酸、賴氨酸、富馬酸、次黃嘌呤、一磷酸腺苷顯著降低;而磷酸膽堿/甘磷酸膽堿、天冬酰胺、天冬氨酸、N-乙酰天門冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、黃嘌呤、肌苷則升高。與模型組比較，治療組腺苷、天冬酰胺、N-乙酰天門冬氨酸、谷氨酰胺、磷酸膽堿、甘磷酸膽堿、肌苷、黃嘌呤等代謝物水平發生逆轉。結論 從代謝角度說明，艾灸干預可調節CAG大鼠局部穴區組織代謝紊亂的神經遞質和能量代謝，可能通過丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，嘌呤代謝和D-谷氨酰胺、D-谷氨酸代謝實現。

〔關鍵詞〕 慢性萎縮性胃炎;艾灸;核磁共振氫譜;代謝通路;神經遞質;能量代謝

〔中圖分類號〕R245.8? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.005

Effect of Moxibustion on Metabolism of Local Acupoint Tissue of Rats with

Chronic Atrophic Gastritis

LIU Qian， YIN Hongzhi， JIN Jiayan， ZHONG Huan*， SHI Jia， CHANG Xiaorong， LIU Mi*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective 1H nuclear magnetic resonance （1H-NMR） technology was used to observe the effect of moxibustion on the metabolism of local acupoint tissue in rats with chronic atrophic gastritis （CAG）， and to explore the possible targets and related metabolic pathways in the treatment of CAG by moxibustion from the perspective of metabolism. Methods According to the random number table method， 42 SD rats were divided into 3 groups （normal group， model group and treatment group）， with 14 rats in each group. The CAG model was prepared by the combined method of N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine （MNNG）. After successful modeling， the normal group and model group were grasped and bound， and the treatment group was treated with moxibustion “Zusanli” （ST36） and “Zhongwan” （RN12） intervention. After 14 days of treatment， HE staining was used to observe the pathological changes of gastric tissue， 1H-NMR technology was used to detect the metabolites of local acupoint tissue in “Zusanli” （ST36）， and the data obtained were analyzed by Chenomx NMR Suite software. Results Under HE staining， the gastric tissue of the model group showed proper gland atrophy and structural disorder， and the number of proper glands was reduced under light microscope， which met the CAG pathological diagnostic criteria. The gastric tissue of the treatment group had a certain degree of improvement. In metabolite analysis， compared with the normal group， glutamine， succinic acid， lysine， fumaric acid， hypoxanthine， and adenosine monophosphate in the model group were significantly reduced; while phosphorylcholine/choline alfoscerate， asparagine， aspartic acid， N-acetyl aspartic acid， tyrosine， phenylalanine， xanthine， and inosine were elevated. Compared with the model group， the levels of metabolites such as adenosine， asparagine， N-acetylaspartic acid， glutamine， phosphocholine， choline alfoscerate， inosine， and xanthine were reversed in the treatment group. Conclusion From the perspective of metabolism， moxibustion intervention can regulate the neurotransmitter and energy metabolism of local acupoint tissue metabolism disorders in CAG rats. It may be realized through the metabolism of alanine， aspartic acid， glutamate， purine metabolism and D-glutamine and D-glutamic acid metabolism.

〔Keywords〕 chronic atrophic gastritis; moxibustion; 1H nuclear magnetic resonance; metabolic pathway; neurotransmitter; energy metabolism

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis， CAG）是臨床常見的消化系統疾病，其病理改變主要是胃黏膜病變，常表現為胃黏膜萎縮、胃上皮異型增生、腸上皮化生等[1-2]，被認為是胃癌的癌前病變階段，嚴重危害人類健康[3-4]，現如今西醫對CAG的治療尚未成熟，還有發展的空間。針灸防治CAG歷史悠久，療效顯著[5-7]。中醫學認為臟腑經絡的病理變化在體表局部穴位有相關反應點，現代研究[8]也發現，內臟炎性損傷可導致相應機體體表穴位局部的理化環境呈現高表達。因此，通過針灸刺激相關穴位可以達到防治CAG的目的。本課題組前期研究[9-14]已證實，艾灸對CAG機體的胃黏膜具有保護作用，同時艾灸正常大鼠的胃經穴可影響胃組織細胞脂質代謝。為了進一步了解艾灸治療CAG的代謝響應機制，本實驗采用核磁共振氫譜技術（1H nuclear magnetic resonance， 1H-NMR），觀察艾灸對CAG大鼠足三里局部穴區組織代謝的影響，以探究艾灸治療CAG潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 動物與分組

SPF級成年SD雄鼠42只，體質量180～220 g，由湖南中醫藥大學動物中心實驗室提供，許可證號：SYXK（湘）2013-0005。于動物中心實驗室分籠飼養，飼養溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。大鼠適應性喂養7 d后，按隨機數字表法分為3組，即正常組、模型組、治療組，每組14只。

1.2? 主要試劑及儀器

N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG）（東京化成工業株式會社，75F7I-TF）;核磁共振儀（德國Bruker，AVANCE Ⅲ HD 850MHZ）;震蕩儀（德國Scientific Industries，Vortex-Genie2）;高速冷凍離心機（上海盧湘儀有限公司，TGL16M）;超純水系統（美國Millipore，Mill-Q）;電子天平（Sartorius公司，BA110S）;艾條（李時珍蘄艾集團湖北有限公司）。

1.3? 模型制備及評定

采用MNNG聯合法[15-16]（MNNG+乙醇灌胃+饑飽失常法）制備CAG大鼠模型，取5 g MNNG配成濃度為1 g/L的原液儲，用錫箔紙包裹后置于 4 ℃冰箱避光冷藏，造模第1天用原液配成170 μg/mL 的MNNG溶液，按1 mL/100 g灌胃1次，隨后用原液配150 μg/mL的MNNG飲用液，裝于錫箔紙包裹的飲水瓶中，供大鼠自由飲用，隔 24 h更換1次。另將無水乙醇混合清水配成濃度為40%的溶液，按照大鼠體質量1 mL/100 g 的量，每周灌胃2次，模擬長期飲酒的習慣。同時配合單雙日饑飽失常法，即單日標準飼料足量喂食，雙日禁食，反復交替。造模持續12周，12周后，每組隨機取2只大鼠，取胃組織（1.0 cm×0.5 cm×1.0 cm）進行HE染色，在光鏡下觀察胃黏膜組織，出現固有腺體萎縮，說明CAG模型成功[17]。

1.4? 干預方法

正常組持續標準飼料喂養;模型組12周后，標準飼料喂養。兩組均只進行抓取、捆綁，15 min/d，連續14 d。

12周后，標準飼料喂養，并予艾灸干預。腧穴選擇：選取雙側足三里穴和中脘穴，穴位定位參照《實驗針灸學》[18]。艾灸方法：穴位局部以75%酒精消毒后，在穴位表面放置孔徑為5 mm的隔熱材料，將艾條（直徑1.8 cm）固定在距穴位上方10～15 cm處施灸，15 min/d，連續14 d，施灸時確保穴位皮膚溫度波動范圍為45～55 ℃。

1.5? 標本采集及指標檢測

1.5.1? 胃組織病理學觀察? 模型評價以及干預14 d后運用HE染色法檢測大鼠胃組織形態。處理前大鼠禁食24 h，用10%水合氯醛溶液給大鼠腹腔注射麻醉后開腹、摘取全胃，沿胃小彎剪開胃部并將其內面外翻，以PBS沖洗干凈，在胃黏膜明顯病變處取標本（約1.0 cm×0.5 cm×1.0 cm），將其放入4%多聚甲醛溶液中，固定24～48 h后將標本梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚約4 μm）后經蘇木素-伊紅染色，置400倍光鏡下觀察。

1.5.2? 局部穴區組織核磁樣品制備與采集? 大鼠腹腔注射麻醉后取“足三里”為中心的穴區組織（約5 mm×5 mm×5 mm），液氮進行組織淬滅后保存于-80 ℃冰箱中。取50～150 mg穴區組織，在0 ℃條件下按4 mL/g的比例加入預冷的甲醇、氯仿，2.85 mL/g比例加入雙蒸水，勻漿1 min、離心（12 000 r/min，5 min，4 ℃），再取0.5 mL上清液（水相），轉移到新的離心管中，經氮吹儀濃縮去甲醇后置于冷凍干燥機中，將冷凍干燥過的樣品取出溶于PBS液中，并將上層清液550 μL轉移到新的核磁管中，離心（1 000 r/min，5 min），4 ℃保存，待測。

采用Bruker核磁共振儀（Avance Ⅲ HD 850 MHz），運用1D noesygppr1d譜脈沖序列采集1H-NMR圖譜。實驗參數：實驗溫度25 ℃，自旋回波時間20 s（參數τ=80 ms，n=126次），Tacq=2.7 s，d1=4 s，采樣點數TD=64 K，譜寬16 ppm（12 kHz），掃描次數NS=256次，空掃次數DS=16次。使用MestReNova 6.1對1H-NMR譜進行分段積分，每段積分區域寬度（binning）為0.001 ppm。將1H-NMR譜的binning值導入MATLAB，使用icoshift算法對譜峰進行峰對齊[19]。

1.6? 數據處理及分析

計算機采集1H-NMR氫譜圖，并對代謝物譜峰進行積分，通過主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對各組大鼠進行代謝模式識別，并結合正交偏最小二乘法（OPLS-DA），根據變量權重值（VIP>1）和獨立樣本t檢驗的P<0.05對差異性代謝物進行篩選，所有圖譜引入SIMCA-14軟件進行處理。同時利用用網站MetPA（http：//www.metaboanalyst.ca）和KEGG在線數據庫進行代謝通路分析。

2 結果

2.1? 各組大鼠胃組織病理形態學比較

造模12周后，模型組光鏡下可見大量淋巴細胞浸潤，固有腺體萎縮、結構紊亂、數量減少，大量主細胞壞死空泡樣變化，纖維組織增生充填，并伴有散在出血點，符合CAG大鼠病理診斷。干預2周后，正常組和模型組大鼠胃組織的形態學和造模12周時基本一致;治療組表現為胃黏膜及黏膜下層有少量淋巴細胞浸潤，仍伴有散在出血點，上皮細胞有脫落現象，部分主細胞有部分空泡樣改變，但不明顯，固有腺體保持相對完整，與模型組相比，有抑制腺體萎縮的趨勢。見圖1。

2.2? 各組大鼠“足三里”穴區組織代謝物的比較

2.2.1? 正常組與模型組“足三里”穴區組織代謝物比較? PCA分析（圖2A）對比表明，正常組與模型組的局部穴區組織代謝模式存在顯著差異，區分主要集中在第一主成分上;PLS-DA分析（圖2B）顯示，兩組樣品區分明顯，且交叉驗證（圖2C）表明PLS-DA建模可靠（其中R2代表訓練集可解釋的方差，而Q2值代表的是該模型的預測能力及其統計有效性。模型的擬合和預測能力均較好，說明其具備充分的生物學可解釋性）;在差異性代謝物指認前需要進行OPLS-DA分析，將差異性變量集中于第一預測主成分上，對模型組和正常組樣品進行兩兩的OPLS-DA分析，其得分圖（圖2D）顯示兩組之間可以很好地區分。與正常組相比，模型組中顯著升高的有磷酸膽堿/甘磷酸膽堿（PC/GPC）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、黃嘌呤（Xan）、肌苷（Ino）;而顯著降低的有賴氨酸（Lys）、谷氨酰胺（Gln）、琥珀酸（Suc）、一磷酸腺苷（AMP）、次黃嘌呤（HX）、富馬酸（Fum）。見圖2E。

2.2.2? 模型組與治療組“足三里”穴區組織代謝物的比較? PCA分析（圖3A）對比表明，兩組局部穴區組織代謝模式能夠明顯區分，治療組有1個樣品分布在 95%置信區間外，有兩個樣品與模型組重疊（這可能是由于組織樣本提取中加入的甲醇還未完全凍干。對這兩張譜中的異常峰剔除后，仍可用于下一步PLS-DA分析）;對兩組樣品進行PLS-DA分析，PLS-DA得分圖（圖3B）顯示兩組樣品可明顯區分，交叉驗證（圖3C）證明PLS-DA模型可靠，表明各組樣品區分的正確性;OPLS-DA得分圖（圖3D）顯示，兩組局部穴區代謝模式能很好區分。CAG狀態下，通過艾灸干預，可引起醋酸（Ace）、腺苷（Ade）、二磷酸腺苷（ADP）顯著升高，丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、天冬酰胺（Asn）、甲基甘氨酸（DMG）、蘇氨酸（Thr）、琥珀酸（Suc）、磷酸膽堿（PC）、甘磷酸膽堿（GPC）、尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）、一磷酸腺苷（AMP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、次黃嘌呤（HX）、肌苷（Ino）顯著降低。見圖3E。

2.3? 代謝通路分析

將1H-NMR找到的模型組與治療組穴區組織19個差異代謝物輸入MetPA（http：//www.metaboanalyst.ca）中進行代謝通路分析，根據代謝通路重要值（impact value）>0.1以及代謝通路富集水平-log10（P）>2作為選擇標準，篩選出3條代謝通路。3條代謝通路包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，嘌呤代謝和D-谷氨酰胺、D-谷氨酸代謝。見圖4。

3 討論

中醫學中沒有關于CAG的具體論述，可以將其歸屬“胃脘痛”“胃痞”“反酸”“嘈雜”等范疇。《素問·本病論》就已經指出“飲食勞倦則傷脾”，到《脾胃論》明確提出“痞自血出”，寒溫不適、喜怒憂恐、飲食失節均會導致氣火失調、內傷脾胃。《景岳全書·心腹痛》云：“食、寒、氣不順均會胃脘痛癥，然食寒二者皆關于氣，食停滯氣，寒留凝氣，故其治病應以理氣為主，觀其果屬實邪。”關于CAG的治療，《靈樞·邪氣臟腑病形》云：“胃病者，腹脹……取之三里也”，足三里既是胃腑的下合穴，又為陽明經合穴，“滎輸治外經，合治內府”“治府者，治其合”都提示足三里可以治療CAG。經現代統計[20]發現，針灸治療CAG的穴位中，足三里和中脘使用頻次居前位，其中足三里使用頻次最高。因此，本實驗選擇足三里和中脘治療CAG大鼠。

代謝組學，即細胞、組織或整個生物體中小分子代謝物的綜合圖譜[21]，是一種新的研究代謝網絡和人體與環境關系的方法[22]，符合中醫學的“整體觀念”。在系統生物學中，代謝組學是各種分子途徑的最終結點[23]，是一種“由果推因”的研究方法。與蛋白質等的變化相比，代謝物的變化能更靈敏地反應機體的微小變化，因而可以采用代謝組學方法探討中醫藥的相關問題，為中醫藥復雜理論體系的研究提供新的思路和方法[24]。

與正常組相比，CAG病理狀態下局部穴區組織處于代謝紊亂狀態，主要體現在能量代謝、神經遞質紊亂。顯著降低的有賴氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、一磷酸腺苷、次黃嘌呤、富馬酸，而顯著升高的有磷酸膽堿/甘磷酸膽堿、天冬酰胺、天冬氨酸、N-乙酰天門冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、黃嘌呤、肌苷。谷氨酸是中樞神經系統中最豐富、快速的興奮性神經遞質，和谷氨酸神經遞質的前體-谷氨酰胺在維持胃腸黏膜的完整性起到重要作用，谷氨酰胺顯著下降，與丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝有關，說明CAG大鼠神經遞質發生紊亂[25-26];N-乙酰天門冬氨酸是神經系統的特定代謝產物，是天門冬氨酸和乙酰輔酶A在神經元線粒體中合成的，N-乙酰天門冬氨酸顯著升高，說明模型大鼠神經系統受到了一定程度的影響[27-28]。琥珀酸在三羧酸循環中起重要作用，并參與三磷酸腺苷的合成[29]，琥鉑酸顯著降低說明模型組大鼠的能量代謝受到影響。

與模型組相比，治療組在艾灸干預后對腺苷、天冬酰胺、N-乙酰天門冬氨酸、谷氨酰胺、磷酸膽堿、甘磷酸膽堿、肌苷、黃嘌呤等水平發生逆轉，主要影響了大鼠局部穴區組織的能量代謝、氨基酸代謝以及核酸代謝等方面，主要效應為調控紊亂的神經遞質及能量代謝，通過丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，嘌呤代謝和D-谷氨酰胺、D-谷氨酸代謝實現。腺苷與磷酸的結合可以用來儲存能量，在能量代謝上扮演著重要角色[30]，腺苷顯著升高提示艾灸通過促進核苷酸的分解以促進局部組織能量代謝;琥珀酰的硫酯鍵水解生成琥珀酸和輔酶A，而琥珀酰在脂肪和蛋白質的新陳代謝中起著重要作用[31-32]，琥珀酸顯著下降也可說明艾灸可調節能量代謝。天冬酰胺、N-乙酰天門冬氨酸、谷氨酰胺的回調說明艾灸干預可能通過調節神經遞質的功能對CAG大鼠產生良性效應。此外，氨基酸中谷氨酸、蘇氨酸、甘氨酸濃度的降低可能是艾灸作用后的生物學效應。如甘氨酸是許多蛋白質的前體，是一種抗氧化劑和內源性抗氧化劑谷胱甘肽的組成氨基酸，通過多種方式抑制體內氧自由基對細胞膜過度氧化造成的損傷[33]。

綜上所述，艾灸干預可以通過對多種代謝路徑的調節，回調與CAG相關的一些代謝物來有效治療CAG。其中，CAG大鼠局部穴區相關能量代謝、氨基酸代謝以及核酸代謝變化明顯。代謝組學的研究目標是代謝終產物，它可以將基因和蛋白表達的微小變化在代謝物水平上放大，因此，代謝組擁有豐富的信息，將其與艾灸作用機制研究相結合，運用代謝組學的多種技術手段觀察艾灸干預后生物體代謝物種類、數量和代謝路徑的變化，構建相關代謝網絡，從而探尋艾灸作用于機體的關鍵靶點和相關代謝路徑，為臨床以及基礎研究提供更多的科研依據。

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