丹參酮IIA對阿霉素耐藥人乳腺癌細胞的多藥耐藥逆轉作用及機制研究

寧玉明，潘一帆，李范珠

丹參酮IIA對阿霉素耐藥人乳腺癌細胞的多藥耐藥逆轉作用及機制研究

寧玉明1，潘一帆1，李范珠2

1.杭州市富陽區婦幼保健院，浙江 杭州 311400 2.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311400

研究丹參酮IIA對阿霉素耐藥人乳腺癌細胞MCF-7/ADR的多藥耐藥逆轉作用及相關機制。分別用丹參酮IIA、阿霉素、阿霉素聯合丹參酮IIA處理人乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞，采用MTT法檢測細胞增殖率；流式細胞術檢測丹參酮IIA干預后MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積量的變化；檢測丹參酮IIA干預后MCF-7/ADR細胞三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）消耗量的變化；采用qRT-PCR、Western blotting法檢測丹參酮IIA干預后MCF-7/ADR細胞ATP結合轉運蛋白B1（ATP-binding cassette transporter B1，）、和基因和蛋白表達的變化。丹參酮IIA顯著抑制MCF-7及MCF-7/ADR細胞增殖（＜0.05），呈劑量相關性；丹參酮IIA能夠逆轉MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥性（＜0.05），增加MCF-7/ADR細胞內阿霉素的蓄積（＜0.05），減少MCF-7/ADR細胞的ATP消耗（＜0.05），顯著下調和基因和蛋白表達（＜0.05）。丹參酮IIA能夠通過調控ABCG2、ABCC1介導的轉運，逆轉MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥性。

丹參酮IIA；阿霉素；乳腺癌；多藥耐藥；ABC轉運蛋白

乳腺癌是全世界女性最常見的癌癥之一，也是女性癌癥死亡的主要原因[1]。化療是治療乳腺癌的主要臨床手段之一。自20世紀30年代后期引入化療以來，已經有200多種化合物被批準用于腫瘤治療。然而癌細胞不斷發展的多藥耐藥性嚴重限制了化療藥物的作用，顯著降低了其臨床療效。乳腺癌細胞的耐藥性往往具有多重機制，其中基因表達導致的多藥耐藥最受關注，特別是三磷酸腺苷結合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）家族成員如ABCB1、ABCG2和ABCC1的過表達，增加了細胞毒性藥物的外排，導致化療藥物細胞內積累減少，療效降低甚至發生耐藥。因此，抑制或下調ABC轉運蛋白的表達成為逆轉多藥耐藥的策略之一[2-3]。自1981年第1個ABCB1抑制劑維拉帕米被報道以來，多種ABC轉運體抑制劑相繼被研究開發，但由于其親和力較低、藥物間不可預測的相互作用和毒性，很少用于臨床常規治療[2,4-5]。此外，大多數已被報道的ABC轉運蛋白抑制劑在體內并沒有表現出預期的抗癌效果[6]。因此，開發新型ABC轉運蛋白抑制劑的研究仍在進行中。

阿霉素屬于蒽環類藥物，是目前治療乳腺癌最有效的化療藥物之一[7]。心臟毒性是其主要不良反應之一。阿霉素是ABCB1、ABCG2及ABCC1的反應底物[8-9]。丹參酮IIA是丹參的脂溶性有效成分，《中國藥典》2020年版將其作為丹參提取物的質量控制指標之一[10-12]。丹參酮IIA具有心血管保護、抗腫瘤的作用[13-20]。研究發現，丹參酮IIA可以增加阿霉素在阿霉素耐藥人乳腺癌細胞MCF-7/ADR中的蓄積，提示丹參酮IIA可能有逆轉人乳腺癌獲得性多藥耐藥的作用[21]。本研究考察丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥逆轉作用及相關機制，以期為乳腺癌治療提供一定的理論依據。

1 材料

1.1 細胞株

人乳腺癌MCF-7細胞及MCF-7/ADR細胞由浙江大學藥學院應曉英研究員惠贈。

1.2 藥品與試劑

丹參酮IIA（批號I14010E8，質量分數≥98%）、鹽酸維拉帕米（批號K1417048，質量分數≥99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸阿霉素（批號1050-C190901，質量分數≥98%）購自浙江海正藥業股份有限公司；ABCG2選擇性抑制劑Ko143（質量分數≥98%）、二甲基亞砜（DMSO）、Triton X-100、cocktail蛋白酶抑制劑購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養基（批號10566-016）、0.25%胰酶-0.02%EDTA、胎牛血清、雙抗購自美國Gibco公司；HBSS、PBS購自杭州吉諾生物制品有限公司；MTT購自美國Amresco公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒、RIPA裂解液（批號P0013）、PMSF（批號ST506）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號P0015）購自碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒（批號CW0014S）購自北京康為世紀生物科技有限公司；TRIzol?Reagent購自英國Invitrogen公司；The first strand cDNA synthesis kit購自美國Thermo Fisher Scientific公司；GoTaq?Qpcr Master Mix購自美國Promega公司；引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成；ABCB1單克隆抗體（批號ab170904）、ABCC1單克隆抗體（批號ab180960）、ABCG2單克隆抗體（批號ab108312）購自英國Abcam公司；GAPDH單克隆抗體（批號E021010-01）購自美國ImmunoWay公司；山羊抗兔抗體（926-68071）、山羊抗鼠抗體（926-32210）購自美國LI-COR公司；其他試劑購自國藥集團有限公司，均為分析純或色譜純。

1.3 儀器

CP225D電子天平（德國Sartorius公司）；Mill-Q超純水儀（美國Millipore公司）；倒置顯鏡（Nikon公司）；低溫離心機、5% CO2培養箱、生物安全柜、Nano Drop分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SpectraMax M2酶標儀、FACSCalibur流式細胞儀（美國MD公司）；PCR儀（德國Eppendorf公司）；qRT-PCR儀、蛋白質電泳及電轉移裝置（美國Bio-Rad公司）；奧德賽紅外熒光成像分析系統（美國LI-COR公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

MCF-7細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗、1%-谷氨酰胺的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱培養，MCF-7/ADR細胞另加入1.840 μmol/L鹽酸阿霉素維持耐藥性。當細胞融合度達到80%～90%，用胰酶消化后傳代。

2.2 MTT法考察丹參酮IIA對MCF-7和MCF-7/ADR細胞存活率的影響

取對數生長期的MCF-7和MCF-7/ADR細胞，PBS漂洗2次，胰酶消化后，1000 r/min離心5 min，用DMEM培養基重懸，以1×104/mL接種于96孔板，培養24 h。吸去培養基，每孔加入150 μL終濃度為0.034、0.170、0.340、0.680、1.700、3.400、17.000、34.000、68.000 μmol/L的丹參酮IIA溶液，另設空白組加入不含藥物的培養基，孵育48 h，棄去培養基，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續培養4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO，搖床振搖10 min，用多功能酶標儀測定570 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.3 MTT法考察丹參酮IIA對MCF-7和MCF-7/ADR細胞阿霉素敏感性的影響

取對數生長期的MCF-7和MCF-7/ADR細胞，PBS漂洗2次，胰酶消化后，1000 r/min離心5 min，用DMEM培養基重懸，以1×104/mL接種于96孔板，培養24 h。吸去培養基，每孔加入150 μL終濃度為0.023、0.230、2.300、11.499、22.998、45.996、91.993、183.986 μmol/L的阿霉素溶液，或各濃度阿霉素聯合丹參酮IIA（0.034、0.340 μmol/L）、各濃度阿霉素聯合鹽酸維拉帕米（2.200 μmol/L）、各濃度阿霉素聯合Ko143（1.065 μmol/L），繼續孵育48 h。按“2.2”項下方法測定值，并計算半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）、耐藥逆轉倍數及耐藥指數。

耐藥逆轉倍數＝阿霉素IC50/聯合用藥IC50

耐藥指數＝MCF-7細胞IC50/(MCF-7/ADR細胞IC50)

2.4 流式細胞術檢測丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積的影響

MCF-7/ADR細胞以3×105/孔接種于6孔板，培養24 h。吸去培養基，PBS漂洗1次，設置對照組、丹參酮IIA（0.034、0.340 μmol/L）組、維拉帕米（2.200 μmol/L）組和Ko143（1.065 μmol/L）組，各給藥組加入1 mL含相應藥物的DMEM培養基，預孵育1或3 h，棄去培養基，另加入1 mL含18.400 μmol/L阿霉素的上述各培養基繼續孵育4 h，對照組只加入含18.400 μmol/L阿霉素的培養基，吸去培養基，PBS洗3次，用250 μL胰酶消化2 min后，加入DMEM培養基終止消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，冰PBS吹勻，1000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，過70 μm濾膜，加至96孔板，采用流式細胞儀測定阿霉素熒光強度。

2.5 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ATP消耗的影響

取對數生長期的MCF-7/ADR細胞，以1×105/孔接種于24孔板，培養48 h，PBS洗3次，設置對照組、丹參酮IIA（0.340、1.700、3.400 μmol/L）組和維拉帕米（2.200 μmol/L）組，各組加入0.5 mL含相應藥物的DMEM培養基，對照組加入不含藥物的培養基，培養48 h。按ATP檢測試劑盒說明書處理細胞，用酶標儀化學發光模塊檢測相對光單位值，通過ATP標準曲線換算成ATP濃度，用BCA蛋白試劑盒檢測每孔細胞蛋白水平校正ATP濃度。

2.6 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞相關基因表達的影響

MCF-7/ADR細胞以2.5×105/mL接種于6孔板，2 mL/孔，培養48 h，吸去培養基，PBS漂洗2次，設置對照組、丹參酮IIA（0.340、1.700、3.400 μmol/L）組和維拉帕米（2.200 μmol/L）組，各組加入1.5 mL含相應藥物的DMEM培養基，對照組加入不含藥物的培養基，培養48 h。PBS洗3次，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞相關蛋白表達的影響

MCF-7/ADR細胞以2.5×105/mL接種于25 cm2培養瓶，4 mL/瓶，培養48 h后，吸去培養基，PBS漂洗2次，設置對照組、丹參酮IIA（0.340、0.680、1.700、3.400 μmol/L）組和維拉帕米（2.200 μmol/L）組，各組加入4 mL含相應藥物的DMEM培養基，對照組加入不含藥物的培養基，培養48 h。收集細胞，4 ℃、3000 r/min離心5 min，棄上清，加入150 μL RIPA裂解液（含cocktail蛋白酶抑制劑及PMSF），于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，100 ℃煮沸10 min，于?70 ℃保存。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%牛血清蛋白封閉1～2 h，分別加入ABCB1、ABCG2、ABCC1抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶5000），4 ℃搖床孵育過夜；加入熒光二抗（1∶5000），室溫避光孵育2 h，TBST緩沖液漂洗5次，8 min/次，采用紅外熒光成像分析系統掃描。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 丹參酮IIA對MCF-7和MCF-7/ADR細胞存活率的影響

如圖1所示，丹參酮IIA（17.000、34.000、68.000 μmol/L）作用于MCF-7細胞48 h后，MCF-7細胞存活率明顯降低；丹參酮IIA（0.680、1.700、3.400、17.000、34.000、68.000 μmol/L）作用于MCF-7/ADR細胞48 h后，MCF-7/ADR細胞存活率明顯降低。因此后續丹參酮IIA分別選取不高于0.340、3.400 μmol/L的濃度對MCF-7和MCF-7/ADR進行實驗。

3.2 丹參酮IIA對MCF-7和MCF-7/ADR細胞阿霉素敏感性的影響

如表2所示，阿霉素分別作用于MCF-7和MCF-7/ADR細胞48 h后，IC50值分別為（1.799±0.109）μmol/L和（34.865±2.383）μmol/L，表明MCF-7/ADR細胞具備耐藥性。與阿霉素組比較，ABCB1經典抑制劑維拉帕米、ABCG2選擇性抑制劑Ko143及丹參酮IIA均能引起MCF-7/ADR細胞阿霉素的IC50值顯著降低（＜0.05），0.034、0.340 μmol/L丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的逆轉倍數分別為1.473、2.510倍。維拉帕米、Ko143對MCF-7和MCF-7/ADR細胞活性的影響已在前期實驗經過考察，本研究中所用濃度均為無毒劑量。結果提示丹參酮IIA可顯著增強MCF-7/ADR細胞對阿霉素的敏感性。

圖1 丹參酮IIA對MCF-7和MCF-7/ADR細胞增殖的影響(, n = 3)

表2 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥逆轉作用(, n = 3)

與阿霉素組比較：*＜0.05**＜0.01

*<0.05**<0.01doxorubicin group

3.3 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積的影響

如圖2所示，孵育時間為1 h時，維拉帕米、Ko143均能顯著增加MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積（＜0.05），丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積作用不明顯。當孵育時間延長至3 h時，各給藥組MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積量均顯著升高（＜0.05、0.01），維拉帕米對MCF-7/ADR細胞內阿霉素蓄積作用最明顯，Ko143的作用最弱，結果與多藥耐藥逆轉實驗基本一致。

3.4 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ATP消耗的影響

ABC轉運蛋白利用ATP作為能量來源介導轉運，細胞內ATP消耗結果見圖3，丹參酮IIA（0.340、1.700、3.400 μmol/L）處理MCF-7/ADR細胞后，胞內ATP消耗量顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性，提示丹參酮IIA可能對包括ABCB1在內的多種ABC轉運蛋白均有抑制作用。

3.5 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ABCB1、ABCC1和ABCG2基因表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，丹參酮IIA（3.400 μmol/L）組MCF-7/ADR細胞mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），丹參酮IIA（0.340、1.700、3.400 μmol/L）組MCF-7/ADR細胞mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），丹參酮IIA（1.700、3.400 μmol/L）組MCF-7/ADR細胞mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），提示丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的逆轉作用可能與下調和mRNA表達有關。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞內ATP消耗的影響(, n = 3)

3.6 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ABCB1、ABCC1和ABCG2蛋白表達的影響

如圖5所示，與對照組比較，丹參酮IIA（0.340、0.680、1.700、3.400 μmol/L）組MCF-7/ADR細胞ABCG2蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），丹參酮IIA（1.700、3.400 μmol/L）組MCF-7/ADR細胞ABCC1蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ABCB1蛋白表達無明顯影響，提示丹參酮IIA逆轉MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥作用與抑制ABCG2和ABCC1蛋白表達有關。

圖4 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ABCB1、ABCG2和ABCC1mRNA表達的影響(, n = 3)

4 討論

隨著我國對中醫藥傳承創新發展的重視，探索中藥聯合化療藥物的療效及作用機制將是抗腫瘤的發展方向之一。研究表明，丹參酮IIA對阿霉素誘導的心臟毒性具有保護作用[17]；阿霉素與丹參酮IIA可協同抑制肝癌HepG2細胞[22]；丹參酮IIA具有一定的多藥耐藥逆轉作用，可通過下調結腸癌細胞ABCB1表達從而增強5-氟尿嘧啶的抗癌活性[23]；丹參酮IIA能夠通過抑制胎盤ABCB1的表達而降低其外排功能[24]，降低ABCB1、DNA拓撲異構酶II（topoisomerase II，TOPO II）的表達逆轉小鼠Lewis肺癌獲得性多藥耐藥性（耐阿霉素）[25]。丹參酮IIA對人ER陰性乳腺癌細胞具有多藥耐藥逆轉作用，其作用機制可能與下調多藥耐藥基因表達有關[26]。丹參酮IIA可通過抑制ABCC1的活性增強阿霉素對耐藥胃癌細胞的抗癌作用[27]。本研究通過聯用丹參酮IIA與阿霉素，考察其對MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的逆轉作用及機制。

圖5 丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞ABCB1、ABCG2和ABCC1蛋白表達的影響(, n = 3)

本研究發現，丹參酮IIA對MCF-7和MCF-7/ADR細胞具有一定的抗腫瘤活性，并且丹參酮IIA聯合阿霉素能夠有效逆轉MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥性。維拉帕米是ABCB1轉運蛋白的底物，能夠與抗癌藥物競爭ABCB1轉運蛋白，抑制其外排，從而逆轉多藥耐藥[28]，Ko143是ABCG2的抑制劑[29]，因此在MCF-7/ADR細胞耐藥逆轉實驗中分別選擇維拉帕米和Ko143作為陽性對照藥物，結果顯示，維拉帕米的耐藥逆轉倍數最高，Ko143的耐藥逆轉倍數最低，而丹參酮IIA的逆轉倍數界于二者之間。阿霉素攝取實驗結果與耐藥逆轉實驗基本一致，提示阿霉素雖然是多種ABC轉運蛋白的底物，但MCF-7/ADR細胞對其耐藥的最主要原因可能是ABCB1介導的轉運作用，丹參酮IIA逆轉MCF-7/ADR細胞阿霉素耐藥的主要作用機制可能與其競爭性抑制ABCB1對阿霉素的外排作用有關，但也不排除丹參酮IIA對多種ABC轉運蛋白均有一定的綜合下調作用。

為了進一步探討丹參酮IIA逆轉MCF-7/ADR細胞多藥耐藥的作用機制，考察丹參酮IIA對MCF-7/ADR細胞、、基因和蛋白表達的影響，發現MCF-7/ADR細胞中、、基因和蛋白表達顯著升高，丹參酮IIA對和mRNA和蛋白表達均有明顯的下調作用，但對ABCB1的下調作用不明顯。對于ABCB1介導的調控，推測丹參酮IIA可能發揮了維拉帕米類似的與抗癌藥物競爭ABCB1引起外排抑制的作用。以上研究表明，丹參酮IIA能夠通過調控多種ABC轉運體尤其是和基因和蛋白表達，逆轉MCF-7/ADR細胞的多藥耐藥性。

丹參酮IIA是中藥丹參中天然的抗腫瘤成分[30]，本研究表明，丹參酮IIA對于有效逆轉化療中出現的多藥耐藥現象提供了一種新的策略，其有可能作為一種潛在化療增敏劑用于治療乳腺癌，對于腫瘤的臨床治療具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Reversal effect and mechanism of tanshinone IIA on multidrug resistance of doxorubicin-resistant human breast cancer cells

NING Yu-ming1, PAN Yi-fan1, LI Fan-zhu2

1.Hangzhou Fuyang Women and Children Hospital, Hangzhou 311400, China 2.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311400, China

To study the reversal effect of tanshinone IIAon multidrug resistance of doxorubicin-resistant human breast cancer cells MCF-7/ADR and related mechanisms.Human breast cancer MCF-7 cells and MCF-7/ADR cells were respectively treated with tanshinone IIA, doxorubicin, doxorubicin + tanshinone IIA, cell proliferation rate was detected by MTT method; Doxorubicin accumulation in MCF-7/ADR cells after tanshinone IIAintervention was detected by flow cytometry; Change of adenosine triphosphate (ATP) consumption in MCF-7/ADR cells after tanshinone IIAintervention was detected; qRT-PCR and Western blotting were used to detect ATP-binding cassette transporter B1 (),andgenes and protein expressions in MCF-7/ADR cells after tanshinone IIAintervention.Tanshinone IIAsignificantly inhibited the cell proliferation of MCF-7 and MCF-7/ADR cells (< 0.05), with dose-dependent; Tanshinone IIAreversed the multidrug resistance of MCF-7/ADR cells (< 0.05), increased the accumulation of doxorubicin in MCF-7/ADR cells (< 0.05), reduced the ATP consumption of MCF-7/ADR cells (< 0.05), down-regulated the expressions ofandgenes and proteins (< 0.05).Tanshinone IIAcan reverse the multidrug resistance of MCF-7/ADR cells by regulating the transport mediated by ABCG2 and ABCC1.

tanshinone IIA; doxorubicin; breast cancer; multidrug resistance; ABC transporter

R285.5

A

0253 - 2670(2021)22 - 6890 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.014

2021-06-17

杭州市科技計劃項目（20171226Y187）

寧玉明（1976—），女，博士，研究方向為藥物新劑型及藥物臨床應用研究。Tel: 13968190002 E-mail: cndnym@163.com

[責任編輯 李亞楠]