RGD環肽修飾的姜黃素/黃芩苷靶向共遞送納米脂質體的制備工藝優化及表征

吳斯宇，曾盈蓉，唐 聘，桂 卉*，胡立志

RGD環肽修飾的姜黃素/黃芩苷靶向共遞送納米脂質體的制備工藝優化及表征

吳斯宇1，曾盈蓉1，唐 聘1，桂 卉1*，胡立志2*

1.湖南中醫藥大學藥學院湖南省中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208 2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005

優化RGD環肽修飾的姜黃素（curcumin，Cur）/黃芩苷（baicalin，Bai）共遞送靶向納米脂質體（RGD-Cur/Bai-Lip）的制備工藝并進行表征評價。采用乙醇注入法制備RGD-Cur/Bai-Lip，首先通過Plackett-Burman篩選實驗確定超聲時間、膽脂比、水合溫度作為制備RGD-Cur/Bai-Lip的關鍵因素，然后采用Box-Behnken響應面法進行工藝優化，以姜黃素包封率、黃芩苷包封率、總載藥量為考察指標，采用AHP-復相關系數法-拉開檔次法進行多指標組合賦權以確定各指標權重系數并計算綜合評分，從而確定RGD-Cur/Bai-Lip的最優處方及關鍵工藝參數。最后對其形態、粒徑電位、穩定性、體外釋放度及溶血性等進行表征評價。優選得到的最佳工藝為膽脂比1∶12，水合溫度60 ℃，探頭超聲時間為10 min。RGD-Cur/Bai-Lip外觀澄清透明，呈亮黃色，對光可視淡藍色乳光，透射電子顯微鏡下觀察形態圓整、分散均勻。平均粒徑為（101.10±0.62）nm，多分散系數（PDI）為0.191 0±0.014 3，Zeta電位為（1.59±0.07）mV，姜黃素包封率為（94.28±4.51）%，黃芩苷包封率為（76.93±1.35）%，總載藥量為（2.27±0.09）%。7 d內穩定性良好，無溶血性，并具有一定的緩釋作用。優化處方后制備的RGD-Cur/Bai-Lip包封率高，粒徑分布均勻，7 d內較穩定，無溶血性，并具有一定的緩釋作用，為RGD-Cur/Bai-Lip的后續抗肝纖維化體內外研究提供了制劑基礎。

脂質體；姜黃素；黃芩苷；RGD環肽；Plackett-Burman設計；Box-Behnken響應面法；AHP-復相關系數法-拉開檔次法

近年來，肝纖維化的發病率逐年增高，引起了全社會的廣泛關注和重視。肝纖維化是由于肝臟在病毒、自身免疫性疾病、藥物等諸多因素的作用下，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）被激活，大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在肝臟中過度堆積形成瘢痕組織而形成[1-2]。已有研究表明[3-4]，姜黃素（curcumin，Cur）與黃芩苷（baicalin，Bai）可以通過不同途徑和通路抑制肝纖維化，發揮協同作用，增強臨床療效。其中姜黃素通過抑制HSC中的Hedgehog（Hh）信號傳導調節細胞代謝和衰老，促進HSC凋亡而逆轉肝纖維化進程；黃芩苷通過抑制肝細胞膜的脂質過氧化，降低α-SMA的表達，抑制肝細胞氧化應激和HSC的活化，從而抑制肝纖維化。

姜黃素與黃芩苷雖具確切治療肝纖維化的療效，但制成普通制劑時存在口服吸收差、穩定性不高和低靶向性等缺點，限制了藥效的充分發揮。脂質體（liposomes，Lip）系指將藥物包封于類脂質雙分子層內而形成的超微球形載體制劑，具有改善藥物溶解性，提高藥物穩定性、增強體內靶向性等優點[5]。此外，已有研究表明[6-7]HSC的激活和增生是肝纖維化發生的中心環節，各種致纖維化因素共同通過這一決定性途徑啟動肝纖維化的過程。RGD環肽[8]具有與HSC表面整合素結合的能力，是整合素與ECM結合識別最常見的位點，能夠特異性地與HSC表面的整合素結合，抑制細胞與細胞、細胞與間質之間的黏附，阻止細胞的增殖、分化，從而逆轉肝纖維化進程。因此本實驗構建主動靶向于HSC的RGD環肽修飾的姜黃素/黃芩苷共遞送靶向納米脂質體（RGD-Cur/Bai-Lip）載藥系統，采用AHP-復相關系數法-拉開檔次法多指標綜合評分以確定權重系數，通過Plackett-Burman篩選實驗設計結合Box-Behnken響應面實驗以確定RGD-Cur/Bai-Lip的最優工藝參數，并進一步進行表征評價，為RGD-Cur/Bai-Lip的后續抗肝纖維化體內外研究奠定制劑基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設備

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀，Agilent ChemStation色譜工作站，美國安捷倫公司；Precisa XB 220A型分析天平，瑞士Precisa重量分析股份公司；01A418型超聲細胞粉碎機、SCIENTZ-10N型冷凍干燥機、Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；ZNCL-G型智能磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52AA型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SPX-250B型恒溫培養箱，上海博泰實驗設備有限公司；H3-20KR型臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器設備有限公司。

1.2 材料與試劑

姜黃素原料藥（批號R30A11S112330，BR，98%）、黃芩苷原料藥（批號G07S11L123706，BR，90%）、姜黃素對照品（批號R08S8S43416，HPLC質量分數≥98%）、黃芩苷對照品（批號P16S8F44143，HPLC質量分數≥98%）、大豆卵磷脂（批號T7011F127302）均購于上海源葉生物有限公司；DSPE-PEG2K-cRGD（批號RMO211108），西安瑞禧生物有限公司；膽固醇（批號20181128），國藥集團化學試劑有限公司；D36 mm透析袋（截留相對分子質量8000～14 000），北京鼎國昌盛生物技術有限公司；無菌脫纖維兔血（批號210624），廣州鴻泉生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸、冰醋酸均為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 RGD-Cur/Bai-Lip制備方法

采用乙醇注入法制備RGD-Cur/Bai-Lip。黃芩苷、RGD環肽溶于pH 6.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中作為水相，大豆卵磷脂、膽固醇、姜黃素溶于無水乙醇中作為油相，將油相勻速滴入水相中，并置于恒溫60 ℃水浴中水化1 h，減壓旋蒸除去乙醇，用PBS定容至20 mL，探頭超聲10 min，分別過0.80、0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件

（1）姜黃素：Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為2%冰乙酸-乙腈溶液（45∶55）；進樣量為10 μL；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為430 nm。

（2）黃芩苷：Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（47∶53）；進樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備

（1）姜黃素對照品溶液：精密稱取稱取姜黃素對照品2.12 mg，置于10 mL棕色量瓶中，以色譜甲醇溶解并定容至刻度線，得到質量濃度為0.212 mg/mL的姜黃素對照品母液，4 ℃冰箱避光密封儲存，待用。

（2）黃芩苷對照品溶液：精密稱取黃芩苷對照品1.17 mg，置10 mL棕色量瓶中，加色譜甲醇適量使全部溶解并定容至刻度線，搖勻，得質量濃度為0.117 mg/mL的對照品母液，4 ℃冰箱避光密封儲存，待用。

2.2.3 供試品溶液的制備 量取RGD-Cur/Bai-Lip溶液2 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入適量甲醇與乙腈1∶1的混合溶劑破乳，混合溶劑定容至10 mL，超聲1 h，靜置24 h，過0.22 μm有機微孔濾膜，4 ℃冰箱避光密封儲存，待用。

2.2.4 空白脂質體供試品溶液的制備 精密量取空白脂質體溶液2 mL，置于10 mL棕色量瓶中，按“2.2.3”項下相同方法處理空白脂質體樣品。

2.2.5 專屬性試驗 分別取“2.2.2”～“2.2.4”項下姜黃素對照品溶液、黃芩苷對照品溶液、RGD-Cur/Bai-Lip供試品溶液、空白脂質體供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件各進樣10 μL，結果見圖1、2，空白脂質體供試品溶液色譜圖未出現對照品對應峰，表明陰性無干擾。

2.2.6 線性關系考察

（1）姜黃素：精密吸取上述“2.2.2”項下姜黃素對照品母液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.75 mL分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得到質量濃度分別為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 mg/mL系列對照品溶液。分別精密吸取各對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下姜黃素色譜條件進樣測定，以進樣質量濃度為橫坐標（），相應的峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得到回歸方程＝485.66＋446.31，2＝0.999 1，結果表明姜黃素在0.010～0.035 mg/mL呈良好線性關系。

圖1 姜黃素對照品(A)、RGD-Cur/Bai-Lip樣品(B)及空白脂質體(C)HPLC圖

圖2 黃芩苷對照品(A)、RGD-Cur/Bai-Lip樣品(B)及空白脂質體(C)HPLC圖

（2）黃芩苷：精密吸取上述“2.2.2”項下黃芩苷對照品母液0.01、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得到質量濃度分別為0.001、0.050、0.100、0.150、0.200、0.250 mg/mL系列對照品溶液。分別精密吸取各對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下黃芩苷色譜條件進樣測定，以進樣質量濃度為橫坐標（），相應的峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得到回歸方程＝37 410－54.361，2＝0.999 7，結果表明姜黃素在0.001～0.250 mg/mL呈良好線性關系。

2.2.7 精密度考察 精密吸取按“2.2.2”項下方法制備的姜黃素對照品溶液和黃芩苷對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下分別連續進樣6次，每次進樣10 μL，其中姜黃素峰面積的RSD為1.02%，黃芩苷峰面積的RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 制備6份RGD-Cur/Bai-Lip供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣，結果姜黃素質量分數的RSD為0.32%，黃芩苷質量分數的RSD為0.18%，表明方法重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取RGD-Cur/Bai-Lip溶液分別于制備后0、3、6、9、12、24 h按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣測定，結果姜黃素峰面積的RSD為2.58%，黃芩苷峰面積的RSD為2.70%，表明RGD-Cur/Bai-Lip供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.10 加樣回收率試驗 制備RGD-Cur/Bai-Lip供試品溶液9份，每份2 mL，分別精密加入低、中、高質量濃度的姜黃素對照品溶液和黃芩苷對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣分析。結果顯示，姜黃素低、中、高質量濃度的平均加樣回收率分別為97.89%、97.75%、99.48%，RSD分別為0.83%、0.31%、1.11%；黃芩苷低、中、高質量濃度的平均加樣回收率分別為96.49%、96.48%、96.99%，RSD分別為1.04%、0.68%、0.58%，說明本方法回收率良好。

2.3 包封率和載藥量的測定

2.3.1 姜黃素包封率的測定 濾膜法[9]是根據脂溶性藥物水溶性差，在水中易形成微粒沉淀的特性，將脂溶性藥物脂質體擠壓通過水系濾膜，而游離藥物被截留在膜上，從而達到游離藥物和脂質體分離的目的。姜黃素屬于強脂溶性藥物，在PBS中會形成較大的聚合物而無法通過水系濾膜，因此選擇濾膜法測定姜黃素包封率。

（1）濾膜法分離效果的考察：按“2.1”項下方法制備2 mg/mL的姜黃素原料藥混懸液，經探頭超聲處理后定容至20 mL量瓶中，取2 mL樣品于10 mL量瓶中，用甲醇-乙腈1∶1混合溶液進行破乳；剩余樣品經0.8、0.45、0.22 μm微孔濾膜濾過，然后用甲醇-乙腈1∶1混合溶液進行破乳，并用HPLC分別測定兩者的含量。結果顯示，過膜前的含量為（945.1±8.8）μg/mL，過膜后的含量僅為（41.2±4.2）μg/mL。上述結果說明姜黃素游離藥物基本被濾膜截留，證明了濾膜法能有效分離脂質體和游離藥物。

（2）濾膜法測定姜黃素包封率：將制備好的RGD-Cur/Bai-Lip樣品依次過0.8、0.45、0.22 μm的水系濾膜，用甲醇-乙腈1∶1混合溶液破乳后得到質量濃度為包，未過膜的脂質體破乳后測得濃度為總。

包封率＝包/總

總為藥物總量，包為包進藥物總量

2.3.2 黃芩苷包封率的測定 經過查閱文獻和預實驗發現，透析法[10]在測定黃芩苷包封率時具有簡單快捷、準確性高等優點，因此本實驗最終采取透析法測定黃芩苷包封率。

精密量取RGD-Cur/Bai-Lip樣品5 mL，置于透析袋內作為內相，以50 mL 5%甲醇-水作為外相，將內置透析袋的燒杯置于25 ℃磁力攪拌器（300 r/min）計時。分別于15、30、45、60、75、120、150、180 min取透析液30 mL，于旋轉蒸發儀上完全旋干，然后加入2 mL甲醇溶解，過膜，進樣HPLC測定，以確定黃芩苷的透析平衡時間。由圖3可知，隨著透析時間的延長，透析介質中黃芩苷游離藥物的峰面積呈上升趨勢，而在45～60 min，峰面積出現平衡趨勢，透析60 min后，峰面積呈大幅上升趨勢，說明透析袋內被包封的脂質體開始被破壞，并通過透析袋進入透析介質中。因此最終確定透析平衡時間為60 min，并通過以下公式計算包封率。

包封率＝(總－游)/總

總為藥物總量，游為游離藥物總量

圖3 黃芩苷透析平衡圖

2.3.3 載藥量的測定 精密量取RGD-Cur/Bai-Lip樣品2 mL置于已干燥至恒定質量的稱量瓶中，冷凍干燥48 h，稱定質量，計算供試品凍干粉凈質量，將凍干粉加入甲醇-乙腈1∶1混合溶液破乳，并定容至10 mL，按照“2.2.1”項下色譜條件分別測定姜黃素和黃芩苷的含量。按照以下公式計算脂質體載藥量。

載藥量＝總/凍干粉凈質量

總為復溶后凍干粉總藥量

2.4 多指標組合賦權

2.4.1 層次分析法（AHP）確定權重 AHP法[11]是指將與決策有關的復雜元素層次化和系統化，在此基礎之上將定性和定量分析相結合的決策方法。運用層次分析軟件YAAHP V12.4.7361，采用1～9標度法對姜黃素包封率（1）、黃芩苷包封率（2）、總載藥量（3）這3個權重指標進行兩兩成對比較，構建指標成對判斷優先矩陣，結果見表1。然后根據和積法計算各指標的權重W1，根據公式CR＝CI/RI（CR：隨機一致性比例因子，CI：一致性指標，RI：平均隨機一致性指標），得到CR＝0.027 9＜0.10，說明指標成對判斷優先矩陣具有很好的一致性，權重系數有效，得3個分權重［姜黃素包封率（AHP1）、黃芩苷包封率（AHP2）、總載藥量（AHP3）］。

表1 指標成對比較判斷優先矩陣

2.4.2 復相關系數法確定權重 復相關系數法[12]屬于客觀賦權法中的獨立權數法，可以依據特征變量間信息的重復性大小賦權。由于選取的特征變量間存在一定的相關性，復相關系數法不僅能避免由于信息重復導致的某方面信息權數過大問題，而且能客觀反映特征變量各個方面的情況。應用Eva Gear Version 2.1.7486軟件計算RGD-Cur/Bai-Lip制備工藝的3個評價指標的權重系數W2，得3個分權重［姜黃素包封率（復相關系數法1）、黃芩苷包封率（復相關系數法2）、總載藥量（復相關系數法3）］。

2.4.3 拉開檔次法確定權重 拉開檔次法提出的基本原則是在指標賦權的過程中盡可能的突出多個被評價對象之間的整體差異，以拉開各被評價對象的檔次，有利于最終結果的排序[13]。應用Eva Gear Version 2.1.7486軟件計算RGD-Cur/Bai-Lip制備工藝的3個評價指標的權重系數j3，得3個權重［姜黃素包封率（拉開檔次法1）、黃芩苷包封率（拉開檔次法2）、總載藥量（拉開檔次法3）］。

2.4.4 AHP-復相關系數法-拉開檔次法組合權重的確定 由AHP得到主觀權重AHPj，由復相關系數法、拉開檔次法得到客觀權重分別為復相關系數法j、拉開檔次法j，則組合權重W按照下列公式計算[14]。

W＝AHPj復相關系數法拉開檔次法/∑(AHPj復相關系數法拉開檔次法)

RGD-Cur/Bai-Lip制備工藝的各評價指標的權重值見表2。

表2 RGD-Cur/Bai-Lip制備工藝評價指標的權重值

2.5 Plackett-Burman設計（PBD）篩選因素

PBD是一種在實驗影響因素較多時，可以用較少的實驗次數快速準確的找到顯著影響因素，減小工作量的實驗設計方法[15]。通過文獻查閱和預實驗結果的綜合分析可知，影響RGD-Cur/Bai-Lip包封率和載藥量的主要因素主要包括：膽脂比（1）、導脂比（2）、總投藥量（3）、油水比（4）、水合溫度（5）、超聲時間（6）、磷酸鹽緩沖液的pH值（7）。

采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行PBD設計，對上述主要影響因素進行考察，每個因素取最低（?1）和最高（+1）2個水平，并以1、2、33個指標的綜合評分（）為總評價指標，運用層次分析軟件YAAHP V12.4.7361和Eva Gear Version 2.1.7486軟件對3個分指標進行組合賦權。PBD設計因素與水平見表3，實驗結果見表4。

采用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件進行數據處理和分析，得到其回歸模型＝85.07＋4.301－0.392－1.903－1.154＋2.735＋5.556＋0.967，通過對實驗數據進行多元回歸分析，結果見表5，回歸模型值為0.018 9＜0.05，值為10.61，說明差異有統計學意義。＝0.948 9，說明模型合理，擬合良好。

表3 PBD因素與水平

表4 PBD實驗考察結果

由圖4可知，1、5、6具有顯著性差異（＜0.01），2、3、4、7則無顯著性影響（＞0.05），顯著性排列順序為6＞1＞5＞3＞4＞7＞2。其中超聲時間是最大的影響因素，超聲時間太短，達不到降低脂質體粒徑和層數的效果，而探頭超聲時間太長，則可能破壞脂質體結構，使脂質體中的藥物泄漏，出現包封率和載藥量下降的現象。膽固醇是脂質體中的穩定劑，當膽脂比較小時，會使脂質體的穩定性下降，出現沉淀現象，而包封率和載藥量也會隨之降低。水合溫度也是一個重要影響因素，當水合溫度過高時，由于磷脂材料的熱不穩定性，會影響脂質體的包封率和載藥量，但水合溫度過低則又達不到相變溫度，難以形成脂質體。

表5 PBD方差分析結果

圖4 標準化效應的正態圖(a)和Pareto圖(b)

2.6 Box-Behnken設計優化實驗

Box-Behnken響應面設計（BBD）是一種尋找多因素系統中最優條件的數理統計方法，是指通過一定數量的實驗次數對各個影響因素及其相互作用進行分析，最終得到直觀三維曲面模型以進行實驗優化[16-17]。通過PBD實驗結果，最終確定超聲時間（6）、膽脂比（1）、水浴溫度（5）作為Box-Behnken響應面設計的3個主要影響因素，每個因素取低（?1）、中（0）、高水平（+1），實驗設計因素與水平見表6，以1、2和3的綜合評分為響應值，運用AHP法-復相關系數法-拉開檔次法對3個分指標進行組合賦權。實驗結果見表7。

表6 BBD因素與水平

表7 BBD實驗考察結果

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行多元線性回歸和二次多項式回歸，并以擬合優度（2）和置信度（）作為模型判定標準，結果見表8。通過模型擬合得到的二次多項式回歸方程為＝93.81＋4.271＋3.355＋2.966－0.7315－1.8316＋0.5356－6.3912－8.3352－3.0262。由方差分析結果可知，回歸模型值＜0.000 1，失擬度檢驗值為6.36，值為0.052 9＞0.05，表明其失擬項水平不顯著，模型擬合較好；回歸方程的決定系數2＝0.975 1＞0.95，說明方程擬合程度良好，可以解釋在97.51%范圍內響應值的變異；信噪比值為 25.634＞4，表明模型合理，可用于進行實驗分析。

根據模型擬合結果，將其中一個因素固定，進行綜合評分對其他兩個因素的擬合，以為評價指標對交互因素的等高線與3D效應曲面圖見圖5。優化后最終確定的處方結果為膽脂比1∶12，水合溫度為60 ℃，超聲時間為10 min。

表8 BBD方差分析結果

2.7 驗證性實驗

對響應面實驗得到的最優工藝處方進行驗證性實驗，即在膽脂比1∶12，水合溫度60 ℃，超聲時間10 min的工藝條件下進行驗證，結果發現實際值與預測值較為接近，相對偏差較小，預測性良好，說明RGD-Cur/Bai-Lip的制備工藝穩定可靠，具體見表9。

2.8 RGD-Cur/Bai-Lip的表征

2.8.1 脂質體的形態觀察 由圖6可見，制備的RGD-Cur/Bai-Lip外觀呈亮黃色，澄清透明，無沉淀，對光透視可見淡藍色乳光，穩定性較好。置于透射電鏡下觀察，RGD-Cur/Bai-Lip形態圓整，呈類球形，分散均勻。

2.8.2 粒徑分布與Zeta電位 根據實驗優化的的最優工藝條件制備RGD-Cur/Bai-Lip，采用激光粒度分析儀測定其粒徑及Zeta電位，結果見圖7。RGD-Cur/Bai-Lip的平均粒徑為（101.10±0.62）nm，分散系數（PDI）為0.191 0±0.014 3，Zeta電位為（1.59±0.07）mV，說明RGD-Cur/Bai-Lip粒徑分布較均勻，分散性好，不易發生絮凝。

2.8.3 穩定性考察 常溫放置RGD-Cur/Bai-Lip，并對其粒徑、Zeta電位以及包封率連續7 d進行測定，考察其穩定性。如表10所示，粒徑、電位和包封率均變化不大，第7天測定的平均粒徑為（117.30±0.56）nm，Zeta電位為（0.95±0.96）mV，姜黃素包封率為93.37%，黃芩苷包封率為75.63%，表明RGD-Cur/Bai-Lip在7 d內穩定性較好。

圖5 各因素間交互作用的3D效應曲面圖及等高線圖

表9 驗證性實驗結果

圖6 RGD-Cur/Bai-Lip的外觀形態(A) 和顯微形態(B)

2.8.4 體外釋放度考察 基于文獻查閱和前期預實驗摸索，最終選擇以含有30%乙醇的PBS溶液[18]作為釋放介質，對RGD-Cur/Bai-Lip進行體外釋放度研究，分別精密吸取3 mL的RGD-Cur/Bai-Lip溶液、姜黃素原料藥混懸液、黃芩苷原料藥混懸液裝入透析袋，在釋放介質中于37 ℃水浴，150 r/min動態透析，分別在0.5、2、4、6、8、10、12、24 h吸取2 mL，然后分別補入同等體積的釋放介質，分別測定樣品中的姜黃素和黃芩苷的含量，根據下列公式[19]計算脂質體的累積釋放度并繪制釋放曲線，結果見圖8。

圖7 RGD-Cur/Bai-Lip的粒徑(A)及Zeta電位(B)分布

表10 穩定性測定結果(n= 3)

＝(補C＋總C)/

指累積釋放度，補指釋放介質的補入體積，C指第次取樣時釋放的藥物濃度，總指釋放介質的總體積，C指第次取樣時的藥物濃度，指脂質體樣品中的藥物含量

圖8 姜黃素原料藥、黃芩苷原料藥及RGD-Cur/Bai-Lip的體外釋放曲線

結果表明，姜黃素原料藥混懸液、黃芩苷原料藥混懸液在12 h時Q均達到了80%以上，而RGD-Cur-Lip和RGD-Bai-Lip的Q僅為29%和23%左右，在24 h時，Q達到了37%和33%左右。通過Origin 2019b軟件，分別應用零級方程、一級方程、Higuchi方程對RGD-Cur/Bai-Lip進行曲線擬合，擬合結果見表11。根據擬合相關系數2可知，RGD-Cur/Bai-Lip均符合Higuchi方程，表明RGD-Cur/ Bai-Lip具有良好的緩釋作用。

2.8.5 溶血性考察 根據《中國藥典》2020年版規定對RGD-Cur/Bai-Lip的溶血性進行評估。取EP管27只，分為3組，分別為空白Lip組、Cur/Bai-Lip組、RGD-Cur/Bai-Lip組，每組9只，對其進行編號（各組中1～6號管為供試品管，7號管為陰性對照管，8號管為陽性對照管，9號管為供試品對照管）。按表12所示依次加入2%紅細胞混懸液、生理鹽水、去離子水，混勻后，立即置于（37.0±0.5）℃的恒溫箱中進行溫浴。3 h后觀察溶血和凝聚反應，結果見圖9。結果可見所有組別均無溶血現象，表明RGD-Cur/Bai-Lip無溶血性，可以用于后續動物實驗的靜脈給藥。

表11 RGD-Cur/Bai-Lip中姜黃素和黃芩苷的體外釋放擬合結果

表12 溶血實驗設計方案

3 討論

本實驗通過Plackett-Burman篩選實驗設計結合Box-Behnken響應面實驗對處方進行了優化，確定的最優工藝條件為膽脂比1∶12，水合溫度60 ℃，探頭超聲時間為10 min。工藝優化后得到的RGD-Cur/Bai-Lip包封率較高，平均粒徑在110 nm以下，粒徑分布均勻，滿足肝靶向脂質體預期的粒徑要求。此外，通過溶血性實驗和體外釋放度考察，發現RGD-Cur/Bai-Lip無溶血反應，并具有良好的緩釋作用。

圖9 溶血性評估圖

RGD-Cur/Bai-Lip的Zeta電位較小，代表其靜電斥力不足以將粒子與粒子排斥開來，理論上易發生聚集，但穩定性實驗卻發現RGD-Cur/Bai-Lip在7 d內粒徑、電位及包封率均無較大變化，原因可能在于RGD環肽表面修飾了含有親水的DSPE-PEG鏈，其親水性與空間效應減少了粒子之間的聚集或吸附現象，可以增強其穩定性。此外，存在RGD-Cur/Bai-Lip包封率較高，但總載藥量較低的現象。有研究表明[20]，當投藥量達到脂質體輔料負載能力的上限時，隨著投藥量的增加，載藥量反而會下降。由于制備脂質體的主要輔料大多都是磷脂和膽固醇等天然成分，對藥物的負載能力有限，因此脂質體等納米制劑大多存在載藥量不高的問題。將在后續實驗中對提高載藥量作進一步的研究。

將姜黃素或黃芩苷包載于脂質體中用于治療肝纖維化的研究已有報道，但肝纖維化病因及機制復雜，多條途徑和通路都可引起肝纖維化，姜黃素和黃芩苷可通過不同的途徑和通路抑制肝纖維化：姜黃素抑制HSC活化、增殖以抗肝纖維化；黃芩苷通過抗氧化應激作用來逆轉肝纖維化。通過構建姜黃素/黃芩苷共遞送納米脂質體，使兩藥合用，通過多途徑抑制肝纖維化，發揮協同作用，療效更佳。HSC的激活和增生是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節，抑制HSC的活化可有效抗肝纖維化。RGD環肽能夠特異性地與HSC表面的整合素結合，阻止細胞的增殖分化。用RGD環肽對姜黃素/黃芩苷共遞送納米脂質體進行修飾，構建靶向于HSC的RGD-Cur/Bai-Lip載藥系統，可以最大限度地將姜黃素和黃芩苷運送至HSC，實現精準靶向給藥，更好地發揮其協同抗肝纖維化作用。但其對HSC的靶向作用還需通過體內外研究得到進一步的證實。本實驗主要研究了RGD-Cur/Bai-Lip的制備工藝及表征，為其后續抗肝纖維化體內外藥效學評價和靶向性研究提供了制劑基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation process optimization and characterization of RGD cyclopeptide modified curcumin/baicalin co-delivery targeted liposomes

WU Si-yu1, ZENG Ying-rong1, TANG Pin1, GUI Hui1, HU Li-zhi2

1.Hunan Key Laboratory of ModernizationResearch of Traditional Chinese Medicine, School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410005, China

To optimize the preparation and characterization of curcumin/baicalin co-delivery targeting nanoliposomes (RGD-Cur/Bai-Lip) modified by RGD cyclopeptide.RGD-Cur/Bai-Lip was prepared by ethanol injection.Ultrasonic time, bile-fat ratio and hydration temperature were determined by Plackett-Burman screening experiment as the key factors for the preparation of RGD-Cur/Bai-Lip.Then the process was optimized by Box-Behnken response surface method, with curcumin entrapment efficiency, baicalin entrapment efficiency and total drug loading as indexes.The AHP-multiple correlation coefficient method-open grade method was used to determine the weight coefficient of each index and calculate the comprehensive score, so as to determine the optimal prescription and key process parameters of RGD-Cur/Bai-Lip.Finally, its morphology, particle size potential, stability,release and hemolysis were characterized and evaluated.The optimum conditions were as follows: the ratio of bile to lipid was 1∶12, the hydration temperature was 60 ℃, and the ultrasonic time of the probe was 10 min.The appearance of RGD-Cur/Bai-Lip was clear and transparent, bright yellow, light blue opalescent light.Under transmission electron microscope, RGD-Cur/Bai-Lip dispersed evenly with round shape.The average particle size was (101.10 ± 0.62) nm, the dispersion coefficient (PDI) was 0.191 0 ± 0.014 3, the Zeta potential was (1.59 ± 0.07) mV, the entrapment efficiency of curcumin was (94.28 ± 4.51)%, the entrapment efficiency of baicalin was (76.93 ± 1.35)%, and the total drug loading was (2.27 ± 0.09)%.It had good stability and no hemolysis within 7 d, and had a certain sustained release effect.This method can effectively and reliably optimize the preparation process of RGD-Cur/Bai-Lip.After optimizing the prescription, the prepared RGD-Cur/Bai-Lip has high entrapment efficiency, uniform particle size distribution and good stability without hemolysis, which provides a preparation basis for the follow-up study of anti-hepatic fibrosis of RGD-Cur/Bai-Lipand.

liposome; curcumin; baicalin; RGD cyclopeptide; Plackett-Burman design; Box-Behnken response surface method; AHP-complex correlation coefficient-open level weight method

R283.6

A

0253 - 2670(2021)22 - 6834 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.008

2021-06-08

湖南中醫藥大學中藥學一流學科開放基金項目（2020ZYX09）

吳斯宇，女，土家族，碩士研究生，中藥學專業。Tel: 15508979610 E-mail: 2464423265@qq.com

通信作者：桂 卉，女，教授，碩士生導師，從事中藥新劑型與新技術研究。Tel: 13707488252 E-mail: 1302985572@qq.com

胡立志，男，碩士，主管中藥師。Tel: 15116424878

[責任編輯 鄭禮勝]