基于Keap1/Nrf2/ARE通路探究黃連素對妊娠合并糖尿病大鼠胰腺的保護作用

朱袁君，崔 瑜，殷 浩

（十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

妊娠合并糖尿病包括糖尿病合并妊娠和妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM），其中GDM約占妊娠期高血糖的90%，即懷孕婦女妊娠前空腹及餐后血糖正常，妊娠后血糖水平異常的疾病[1]。目前，我國GDM的總患病率為14.8%，且有逐年上升趨勢[2]。妊娠合并糖尿病可導(dǎo)致妊娠期高血壓、羊水過多、早產(chǎn)、巨大兒、新生兒呼吸窘迫綜合征等，雖然部分患者在產(chǎn)后血糖可恢復(fù)正常，但產(chǎn)后糖尿病的發(fā)病風(fēng)險明顯升高，嚴重威脅著母嬰健康[3]。妊娠期孕產(chǎn)婦血糖異常與胰腺功能異常密切相關(guān)，但目前大部分的藥物僅在已經(jīng)受損的胰島組織基礎(chǔ)上促進胰島素分泌，并未針對受損的胰腺組織進行修復(fù)，也因此無法抑制胰腺功能的逐漸減退[4]。

黃連素是黃連的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病也有明顯的改善作用。在動物實驗中，黃連素亦表現(xiàn)出較好的安全性，能夠降低子癇大鼠的血壓，減輕腎損傷，增加正常胎兒的數(shù)量和體質(zhì)量[5-8]。研究證明，黃連素對2型糖尿病具有明顯治療作用，對GDM大鼠也具有降低血糖、改善胰島素抵抗的作用，但其作用機制仍需進一步探討[9-10]。本研究通過建立妊娠合并糖尿病大鼠模型考察黃連素對GDM大鼠胰腺的保護作用，并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級成年雌性SD大鼠60只，雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2017-0001，飼養(yǎng)在河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房，動物使用許可證號：SYXK（豫）2016-0002。飼養(yǎng)條件為室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12 h/12 h光暗照明，食水不限。研究方案獲本院倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 黃連素（上海一基實業(yè)有限公司，純度≥98%，批號：2086-83-1）；鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：1710083）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號：S8050）；胰島素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-EL-R2614c，E-BC-K022-S，E-BCK096-S，E-BC-K031-S，E-EL-0060c）；Bcl-2相 關(guān)X蛋 白（Bcl-2-associated X protein gene，Bax）、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）、NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：60267-1-Ig，60178-1-Ig，60027-1-Ig，66504-1-Ig，66743-1-Ig，60004-1-Ig）。

1.3 主要儀器ONETOUCH型血糖儀（強生上海醫(yī)療器械有限公司）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；G:BOX型多功能凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）。

1.4 造模與分組 本研究造模方法參考文獻[11]，選取未交配過的雌性SD大鼠60只和雄性SD大鼠30只，將處于動情前期的雌鼠與雄鼠按2∶1的比例合籠交配，次日早晨鏡檢雌鼠陰道分泌物，若觀察到陰栓即確定為妊娠第1天。經(jīng)觀察，有54只大鼠妊娠成功。將孕鼠隨機分為空白組、模型組、二甲雙胍組、黃連素高劑量組、黃連素中劑量組和黃連素低劑量組，每組9只。妊娠第5天時，除空白組大鼠腹腔注射等量生理鹽水外，其余各組大鼠腹腔注射35 mg/kg STZ溶液，3 d后檢測大鼠空腹血糖水平，若空腹血糖水平≥13.5 mmol/L，表明妊娠合并糖尿病模型建立成功。

1.5 實驗給藥 確認模型建立成功的當天開始給藥，二甲雙胍組大鼠灌胃二甲雙胍溶液，200 mg/kg，黃連素高、中、低劑量組大鼠分別灌胃高劑量（100 mg/kg）、中劑量（50 mg/kg）、低劑量（25 mg/kg）黃連素溶液，空白組和模型組大鼠灌胃等體積冷開水，1次/d，連續(xù)6周。

1.6 觀察指標

1.6.1 血糖和胰島素水平 給藥前及給藥后第2、4、6周時，各組大鼠尾靜脈采集血液1 mL，通過血糖儀和胰島素檢測試劑盒分別測定大鼠空腹血糖水平和胰島素水平。

1.6.2 胰腺組織病理變化 末次給藥后，通過腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，頸椎脫臼法處死后分離胰腺組織，生理鹽水清洗至無血絲，一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）及TUNEL（TdT-mediated dUTP nick-end labeling）染色，另一部分凍存于-80℃，用于試劑盒、Western blotting檢測。胰腺組織用4%多聚甲醛固定，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片（厚度為4 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，行HE染色觀察胰腺組織病理變化。

1.6.3 TUNEL法觀察胰島細胞凋亡情況 切片制備方法同“1.6.2”。切片標本常規(guī)脫蠟、復(fù)水，滴加蛋白酶K溶液，室溫水解15 min去除組織蛋白，蒸餾水清洗后放置在含2%過氧化氫的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中反應(yīng)5 min，滴加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT）反應(yīng)液2滴，置濕盒中37℃孵育1 h，滴加50 μL過氧化物標記的抗地高辛抗體，然后將切片放置在濕盒中室溫孵育0.5 h，PBS清洗后滴加DAB溶液，室溫孵育3~6 min顯色，蒸餾水終止，蘇木精染細胞核2 min，脫水、透明后用中性樹膠封片，顯微鏡高倍鏡下觀察，每組隨機取4個視野拍照，計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），即每組選取5個陽性細胞數(shù)最多的高倍視野，計算500個細胞中陽性細胞所占的百分比。1.6.4 ELISA法測定胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量 取大鼠胰腺組織，加入預(yù)冷PBS緩沖液，冰上勻漿，10 000 r/min離心10 min取上清，離心半徑為12.5 cm，分裝在EP管中，-80℃保存。根據(jù)SOD、GSH-Px、CAT和MDA試劑盒操作方法，通過紫外可見分光光度計測定大鼠胰腺組織中SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量。

1.6.5 Western blotting檢 測 胰 腺 組 織Bax、Bcl-2及Keap1/Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response elements，ARE）信號通路蛋白表達水平 取大鼠胰腺組織，冰上研磨勻漿，加入裂解液提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入loading buffer，在EP管中混勻后置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液清洗后將條帶放入10 mL Bax、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1、GAPDH兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1 000，4℃環(huán)境下孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）中，在37℃環(huán)境下孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實驗的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個蛋白對應(yīng)的灰度值，計算蛋白相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。重復(fù)測量計量資料比較，采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖和胰島素水平比較 給藥前后不同時間點之間大鼠血糖水平和胰島素水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即存在時間效應(yīng)；二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠血糖水平隨著時間延長逐漸降低，胰島素水平隨著時間延長逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。空白組、模型組、二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠血糖水平和胰島素水平整體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)；給藥前，模型組，二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠空腹血糖水平均高于空白組（P＜0.05），胰島素水平均低于空白組（P＜0.05），給藥后，二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠空腹血糖水平低于模型組（P＜0.05），胰島素水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。時間因素和分組因素存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表1~2、圖1~2）

圖1 大鼠空腹血糖水平時間和分組交互效應(yīng)輪廓圖

圖2 大鼠胰島素水平時間和分組交互效應(yīng)輪廓圖

表2 各組大鼠胰島素水平比較（±s，mmol/mL）

表2 各組大鼠胰島素水平比較（±s，mmol/mL）

注：F時間主效應(yīng)=17.331，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=22.012，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=9.504，P交互效應(yīng)=0.000；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與黃連素高劑量組比較，dP＜0.05；與黃連素中劑量組比較，eP＜0.05

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2.2各組大鼠胰腺組織病理變化情況 空白組大鼠胰島細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，細胞質(zhì)含量豐富，胰島細胞數(shù)量多，未見異常；與空白組比較，模型組大鼠胰島細胞明顯減少，細胞腫脹、結(jié)構(gòu)不完整，排列紊亂；與模型組比較，二甲雙胍組和黃連素高、中劑量組大鼠胰腺組織細胞損傷得到明顯改善，胰島細胞數(shù)量增加，胞核胞質(zhì)清晰，但黃連素低劑量組大鼠仍可見胰腺組織細胞紊亂現(xiàn)象。（見圖3）

圖3 各組大鼠胰腺組織病理變化比較（HE，×400）

2.3 各組大鼠胰島細胞凋亡情況比較6組大鼠胰腺組織細胞AI值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進一步兩兩比較結(jié)果顯示：空白組大鼠胰島細胞幾乎無凋亡現(xiàn)象，與空白組比較，模型組、二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠均存在胰島細胞凋亡，AI值均升高（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和黃連素高、中劑量組大鼠胰島凋亡細胞數(shù)量均減少，AI值均降低（P＜0.05），而黃連素低劑量組大鼠凋亡細胞數(shù)量和AI值與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與二甲雙胍組比較，黃連素高、中、低劑量組大鼠AI值均升高（P＜0.05）。與黃連素高劑量組比較，黃連素中、低劑量組大鼠AI值均升高（P＜0.05），胰島凋亡細胞均增加。黃連素中劑量組大鼠胰島凋亡細胞數(shù)量低于黃連素低劑量組（P＜0.05）。（見圖4、表3）

圖4 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡情況比較（TUNEL，×400）

表3 各組大鼠胰腺組織細胞AI值比較（±s）

表3 各組大鼠胰腺組織細胞AI值比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與黃連素高劑量組比較，dP＜0.05；與黃連素中劑量組比較，eP＜0.05

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2.4 各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較6組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果顯示：模型組、二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠胰腺組織Bax蛋白相對表達量均高于空白組（P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達量均低于空白組（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和黃連素高、中劑量組大鼠胰腺組織Bcl-2蛋白相對表達量均增加（P＜0.05），Bax蛋白相對表達量均減少（P＜0.05）；黃連素低劑量組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。黃連素高劑量組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與二甲雙胍組比較，黃連素中、低劑量組大鼠胰腺組織Bax蛋白相對表達量均增加（P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達量均減少（P＜0.05）。黃連素中劑量組大鼠胰腺組織Bax蛋白相對表達量低于黃連素低劑量組（P＜0.05），Bcl-2蛋白相對表達量高于黃連素低劑量組（P＜0.05）。（見表4、圖5）

表4 各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與黃連素高劑量組比較，dP＜0.05；與黃連素中劑量組比較，eP＜0.05

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圖5 各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白表達Western blotting圖

2.5 各組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較6組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果顯示：模型組、二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性均低于空白組（P＜0.05），MDA含量高于空白組（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性均增加（P＜0.05），MDA含量均降低（P＜0.05）。與二甲雙胍組比較，黃連素高劑量組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性增加（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0.05），而黃連素中劑量組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量與二甲雙胍組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；黃連素低劑量組大鼠胰腺組織SOD活性與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），GSH-Px、CAT活性低于二甲雙胍組（P＜0.05），MDA含量高于二甲雙胍組（P＜0.05）。黃連素的作用呈劑量依賴性。（見表5）

表5 各組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較 （±s）

表5 各組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與黃連素高劑量組比較，dP＜0.05；與黃連素中劑量組比較，eP＜0.05

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2.6 各組大鼠胰腺組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較6組大鼠胰腺組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果顯示：模型組大鼠胰腺組織Keap1蛋白相對表達量高于空白組（P＜0.05），Nrf2、HO-1蛋白相對表達量低于空白組（P＜0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和黃連素高、中、低劑量組大鼠胰腺組織Keap1蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）。二甲雙胍組大鼠胰腺組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量與黃連素高劑量組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與二甲雙胍組比較，黃連素中、低劑量組大鼠胰腺組織Keap1蛋白相對表達量均升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。黃連素中劑量組大鼠胰腺組織Keap1蛋白相對表達量低于黃連素低劑量組，Nrf2、HO-1蛋白相對表達量高于黃連素低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表6、圖6）

表6 各組大鼠胰腺組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較（±s）

表6 各組大鼠胰腺組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與二甲雙胍組比較，cP＜0.05；與黃連素高劑量組比較，dP＜0.05；與黃連素中劑量組比較，eP＜0.05

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圖6 各組大鼠胰腺組織Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達Western blotting圖

3 討 論

GDM是由于妊娠后母體糖代謝異常而首次發(fā)生的糖尿病，極易造成產(chǎn)婦出現(xiàn)先兆子癇、胎膜早破、早產(chǎn)等，增加母兒患2型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險[12]。目前，治療GDM主要通過飲食控制、運動和胰島素等對癥療法，尚缺乏真正有效的防治方法。因此，尋找安全有效的藥物防治GDM是目前圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)研究的重要任務(wù)。黃連味苦、性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，對糖尿病疾病有治療作用[13]。研究表明，黃連的有效成分黃連素可改善GDM大鼠胰島素抵抗，降低血糖，但其作用機制仍需進一步闡明[14-15]。

本研究通過向孕鼠腹腔注射STZ制備妊娠合并糖尿病模型，結(jié)果顯示大鼠空腹血糖水平顯著升高，胰島素水平顯著降低，表明模型建立成功。使用黃連素治療后，結(jié)果顯示，從第2周至實驗結(jié)束，黃連素可降低包括大鼠生產(chǎn)前后階段的空腹血糖水平，增加胰島素分泌。HE和TUNEL染色顯示，黃連素能減輕孕鼠胰島損傷，減輕胰島細胞凋亡，AI指數(shù)顯著降低，這一現(xiàn)象在Bax和Bcl-2蛋白表達水平檢測中得到驗證，即黃連素降低了Bax的表達，增加了Bcl-2的表達。Bcl-2和Bax是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因，Bax過表達可促進細胞凋亡，而Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制Bax基因的表達，從而抑制細胞凋亡[16]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是組織損傷的基本病理過程，MDA的含量高低能夠直接反映機體的氧化應(yīng)激水平，與MDA相反，SOD、GSH-Px、CAT屬于抗氧化酶系統(tǒng)的重要分子，可清除有害氧自由基，抑制機體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡[17]。本研究顯示，糖尿病孕鼠胰腺組織SOD、GSH-Px、CAT活性降低，MDA含量升高，而黃連素能夠增加SOD、GSH-Px、CAT活性，減少MDA含量。以上研究表明，黃連素對GDM具有治療和改善作用，能減輕胰腺損傷。

Keap1/Nrf2/ARE信號通路是人體重要的抗氧化應(yīng)激通路，Keap1是Nrf2在細胞質(zhì)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。正常情況下，Keap1與Nrf2在胞質(zhì)結(jié)合抑制Nrf2進入細胞核，Nrf2處于非激活狀態(tài)，而在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1脫離，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中，并與下游基因啟動子ARE結(jié)合，上調(diào)可以催化多種抗氧化途徑的下游基因HO-1的轉(zhuǎn)錄和表達，從而實現(xiàn)維持細胞氧化平衡，保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[18-19]。研究表明，調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE信號通路，增加Nrf2/Keap1復(fù)合物的解離，促進Nrf2的表達能夠減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病氧化應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)并發(fā)癥[20]。與上述研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病孕鼠胰腺組織Keap1表達升高，Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低，而使用黃連素干預(yù)后，胰腺組織Keap1蛋白表達水平降低，Nrf2、HO-1蛋白表達水平升高，表明黃連素對Keap1-Nrf2/ARE信號通路有調(diào)控作用。

綜上所述，黃連素可降低GDM大鼠血糖，促進胰島素分泌，減輕胰腺氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡，其作用機制可能與激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。