西紅花苷對重癥胰腺炎大鼠炎癥反應及細胞凋亡水平的抑制作用*

謝松波，胡 卓，呂 揚，陳華文

（1.監利市人民醫院，湖北 監利 433300；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）屬于臨床上常見的急腹癥，其臨床表現病情危重、發病進展快、死亡率高，這是由于炎癥因子的過度釋放導致腸黏膜損傷，引發全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征，從而加劇病情[1-3]。因此，控制或者減輕重癥胰腺炎病情具有重要的臨床價值。西紅花苷（Crocin），又稱為藏紅花素，是西紅花（藏紅花）的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等作用[4-5]。研究表明西紅花苷對腦、心肌等組織的損傷具有一定的保護作用[6-7]。本研究將通過建立SAP大鼠模型并給予西紅花苷治療，通過檢測相關指標來進一步探討西紅花苷對重癥胰腺炎引起的胰腺組織損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級健康雄性SD大鼠32只，體質量190~220 g，由北京安凱毅博生物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2017-0006。飼養于溫度26~28℃、濕度50%~60%的適宜條件下，光照/黑暗時間為12 h/12 h，使用無菌水和飼料飼養1周后進行造模處理。實驗經監利市人民醫院倫理委員會批準，編號：20181106X。

1.2 藥物與試劑 西紅花苷（南通飛宇生物科技有限公司，貨號：FY1698）；牛黃膽酸鈉（北京索萊寶科技有限公司，貨號：T8510）；大鼠淀粉酶（amylase，AMS）ELISA試劑盒（江蘇江萊生物科技有限公司，貨號：JL20962）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：PT516）；大鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（貨號：PI303）；大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（貨號：PI328）；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）（貨號：C1089）；蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）（貨號：C0105）（上海碧云天生物技術有限公司）；Bcl2相關X蛋白（Bcl2 associated X protren，Bax）兔單克隆抗體（貨號：ab32503）；Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）兔單克隆抗體（貨號：ab108596）；信號轉導和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）兔單克隆抗體（貨號：ab68153）；β-肌動蛋白（β-actin）兔多克隆抗體（貨號：ab8226）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號：ab205718）[艾博抗（上海）貿易有限公司]；PrimeScriptTMRT reagent Kit（貨號：RR037A）、Premix Ex TaqTM（貨號：RR390A）[寶日醫生物技術（北京）有限公司]；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Cystein aspartic protease 3，cleaved-Caspase-3）兔單克隆抗體（貨號：9661S）；p-JAK2兔單克隆抗體（貨號：3771S）；p-STAT3兔單克隆抗體（貨號：9145S）（上海優寧維生物科技股份有限公司）。

1.3 主要儀器7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；DM1000 LED正置顯微鏡、DM2000熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Multiskan Sky全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CL-1000i全自動化學發光儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；Microfuge 20高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.4 造模與分組 將32只大鼠隨機分為假手術組、模型組、西紅花苷低劑量組、西紅花苷高劑量組，每組8只。模型組和西紅花苷低、高劑量組大鼠采用向膽胰管內注射5%牛黃膽酸鈉建立SAP大鼠模型[8]。采用異氟烷吸入式麻醉大鼠，經腹正中切口進入腹腔，找到十二指腸和膽胰管并用血管夾夾閉，逆行膽管勻速注射5%牛黃膽酸鈉（0.011 mL/100 g）。注射后5~10 min肉眼觀察胰腺組織水腫、胰膽管周圍組織出現磚紅色改變，即建模成功。去除血管夾，關腹。假手術組大鼠僅開腹，翻動十二指腸和胰腺數次后關腹。

1.5 實驗給藥 給藥前，西紅花苷加入生理鹽水溶解，制成質量濃度為200 μg/mL的藥液并進行分裝保存備用。造模成功后，西紅花苷低劑量組大鼠尾靜脈注射25 mg/kg西紅花苷溶液，西紅花苷高劑量組大鼠尾靜脈注射50 mg/kg西紅花苷溶液[9]，模型組和假手術組大鼠靜脈注射等量的生理鹽水，1次/d，連續注射1周。

1.6 觀察指標

1.6.1 ELISA法檢測大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6含量 所有大鼠在治療后，抽取腹主動脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min，收集上層血清。按照大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒的使用說明書測定樣品的吸光度值，計算含量。

1.6.2 HE染色檢測大鼠胰腺組織病理形態學改變 頸椎脫臼法處死各組大鼠，取大鼠胰腺組織制成標本（0.5cm×0.5cm），使用4%甲醛溶液進行固定，然后進行石蠟包埋、脫水并制成切片，進行蘇木精-伊紅染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠胰腺組織病理變化。

1.6.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 將制備的切片進行脫蠟處理，滴加20 μg/mL蛋白酶K，37℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗滌3次。然后滴加50 μL TUNEL檢測混合液（5 μL TdT酶+45 μL熒光標記液），37℃避光孵育60 min，1×PBS溶液洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察。1.6.4 RT-qPCR檢測JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達水平取大鼠的胰腺組織，使用Trizol法提取組織中的總RNA，使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，然后通過實時熒光定量PCR檢測JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達水平。反應條件為94℃預變性30 s，40個循環擴增反應（94℃5 s，60℃20 s）。以β-actin為內參，采用公式（2-△△Ct）計算其相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.6.5 Western blotting檢 測Bax、cleaved-Caspase-3、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3蛋白表達 使用RIPA裂解液提取大鼠胰腺組織中總蛋白，定量后進行SDS-PAGE電泳（80 V 30 min，100 V 90 min）、轉膜（100 V，100 min），再使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗（1∶1 000）4℃過夜孵育。加入二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h。通過ECL化學發光法并使用全自動化學發光儀來分析蛋白條帶。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清學指標的檢測比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量均不同程度下降（P＜0.05）；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清炎癥因子及淀粉酶含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清炎癥因子及淀粉酶含量比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西紅花苷低劑量組比較，cP＜0.05

?

2.2 各組大鼠胰腺組織病理變化情況 假手術組大鼠胰腺組織無炎癥細胞浸潤、間質水腫等病理性改變；模型組大鼠胰腺組織出現大量炎癥細胞浸潤、間質水腫及組織壞死；西紅花苷低劑量組大鼠胰腺組織組炎癥細胞浸潤和水腫情況較模型組略有改善；西紅花苷高劑量組大鼠胰腺組織炎癥細胞浸潤顯著減少，水腫以及組織壞死得到顯著改善。（見圖1）

圖1 各組大鼠胰腺組織病理變化比較（HE，×100）

2.3 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠胰腺組織細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量均不同程度下降（P＜0.05）；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組大鼠胰腺組織細胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。（見圖2、表3）表3各組大鼠胰腺組織細胞凋亡水平及相關蛋白表達比較（±s）

圖2 各組大鼠胰腺組織細胞凋亡及相關蛋白表達情況

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西紅花苷低劑量組比較，cP＜0.05

2.4各組大鼠JAK2/STAT3信號通路相關基因及蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。

與假手術組比較，模型組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.05）；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。（見圖3~4、表4）

圖3 各組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達量比較 （±s，n=8）

表4 各組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西紅花苷低劑量組比較，cP＜0.05

?

3 討 論

重癥急性胰腺炎是臨床上常見的急腹癥，除帶來局部的病理損傷外，還伴隨著強烈的全身炎癥級聯反應，甚至會引起全身多器官衰竭，乃至死亡的發生[10]。重癥胰腺炎的治療方法常包括胃腸減壓、抑制胰腺外分泌、抑制胰酶活性、預防性抗生素使用等，但其治療存在一定的局限性，例如治療周期長，臨床療效差，并發癥多等[11]，因此尋找有效的重癥胰腺炎治療藥物具有重要的臨床應用價值。

西紅花苷具有多重生物學活性。ZAGHOULM S等[12]研究表明西紅花苷對博來霉素（bleomycin，BLM）誘導的肺纖維化具有明顯的抗氧化、抗炎及抗纖維化作用。LI X等[13]研究表明西紅花苷能夠通過抑制細胞因子表達來減少類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）的炎癥反應。本研究建立了重癥胰腺炎SD大鼠模型并采用西紅花苷進行治療，HE染色結果顯示，模型組大鼠胰腺組織出現大量炎癥細胞浸潤、間質水腫以及組織壞死，西紅花苷干預后，大鼠胰腺組織炎癥細胞浸潤顯著減少，水腫及組織壞死得到改善。提示西紅花苷能夠減輕重癥胰腺炎的炎癥反應，改善胰臟組織損傷。

TNF-α、IL-1β、IL-6在炎癥反應引起的重癥胰腺炎的發病中起著重要的作用，TNF-α能夠介導多種炎癥因子（IL-1β、IL-6等）的釋放，促進白細胞的趨化反應和黏附，進而損傷胰腺組織[14]。IL-1β是促炎性細胞因子，在重癥胰腺炎中參與胰腺組織的破壞和水腫形成[15]。IL-6是一類非特異性炎癥因子，參與全身性炎癥反應，在機體的抗免疫反應中起到重要的作用[16]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量顯著升高；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量均存在不同程度下降。這提示西紅花苷通過抑制炎癥細胞因子的表達進而降低胰腺組織的炎癥水平。本研究結果顯示，模型組大鼠胰腺組織細胞凋亡率，以及凋亡相關蛋白Bax、cleaved-Caspase-3表達水平顯著升高；西紅花苷干預后，大鼠胰腺組織細胞凋亡率，以及Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著下降。提示西紅花苷通過降低細胞凋亡率發揮對重癥胰腺炎的保護作用。

JAK2/STAT3信號通路是一個將細胞外信號轉導至細胞內的二級聯信號，跨膜受體活化后將信號傳導至細胞內，參與細胞增殖、分化、凋亡、細胞免疫等過程[17]。LI M等[18]研究表明JAK2抑制劑AG490處理后會降低大鼠促炎性細胞因子的活性，并顯著減輕胰腺炎相關的肝損傷。GAO H Y等[19]結果顯示在2型糖尿病大鼠模型中二甲雙胍能夠在高血糖培養條件下激活JAK2/STAT3途徑并減輕細胞凋亡。本研究結果顯示，模型組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達，以及JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均升高；西紅花苷干預后，JAK2/STAT3信號通路相關指標表達水平均顯著下降。這提示西紅花苷可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活發揮保護作用。

綜上所述，西紅花苷能夠抑制重癥胰腺炎大鼠炎癥反應及細胞凋亡，對重癥胰腺炎大鼠起到保護作用，其機制可能與西紅花苷抑制JAK2/STAT3信號通路有關。本研究為臨床治療重癥胰腺炎提供了新的思路。