基于糖皮質激素受體介導TGF-β1/Smad3信號軸探討小青龍湯加減合二陳湯治療咳嗽變異性哮喘的藥效及機制*

任宇哲，萬 軍，于 宙，楊澤一，楊祥正

（1.北京中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518100；2.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是我國臨床慢性咳嗽的首要病因，主要癥狀表現為慢性咳嗽。氣候變化、感染、運動均會引起CVA反復發作，嚴重影響人們的日常生活[1]。當前，臨床治療CVA首選方案為支氣管擴張劑與抗炎藥聯合用藥，能夠在一定程度上控制CVA患者氣道炎性反應，緩解氣道痙攣，減少CVA季節性發作，但并不能根治CVA[2]。西藥治療的禁忌證與毒副作用也會在一定程度上影響治療效果，尋找療效顯著且毒副作用較小的藥物是臨床治療CVA的迫切需求。當前研究證實了氣道炎癥是CVA最主要的病理變化，抑制氣道重塑與炎癥反應相關靶點可能成為治療CVA的有效策略[3]。糖皮質激素類藥物在哮喘患者局部呼吸道治療中具有顯著功效，其中糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）可以募集共調節因子并發揮重要的調節作用，調控GR可能是治療哮喘的重要靶點[4]。基于GR介導TGF-β1/Smad3信號軸可能成為CVA治療的重要研究方向。中醫作為中華民族的傳統醫學，在疾病的治療與預防中一直起到重要作用。小青龍湯加減廣泛用于兒童CVA臨床治療，其療效優于西藥治療，且復發率較低。二陳湯多用于CVA藥物聯用治療，其療效與西藥相當。兩方聯用在臨床治療CVA及各類支氣管咳嗽中均表現出較好成效，但尚未有兩方聯用對CVA大鼠藥效及作用機制的相關研究。本次研究通過復制CVA大鼠模型探討小青龍湯加減合二陳湯治療CVA的藥效及機制，旨在為小青龍湯加減合二陳湯治療CVA提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3月齡SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質量（200±20）g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，合格證號：0001507。在室溫22~24℃，相對濕度45%~55%環境中適應性飼養1周，期間自由進食飲水，12 h交替光照，處理方法遵守動物倫理原則，該實驗經倫理委員會批準，倫理號：JN.No201 91215S0427210。

1.2 藥物與試劑 小青龍湯加減合二陳湯，藥物組方：白芍18 g，陳皮、半夏、茯苓各12 g，炙麻黃、干姜各10 g，桂枝9 g，五味子8 g，細辛3 g，甘草6 g。按照處方比例將藥物混合，料液1∶10，浸泡2 h。煎煮2次，每次2 h，將2次獲得的煎煮液混合濃縮至相應濃度，低溫保存備用。卵清白蛋白（美國Sigma，批號：A5253）；布地奈德（AstraZeneca Pty Ltd，批準文號：H20140475，規格：1 mg/2 mL）；IL-4 ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER0041）；ECP ELISA試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，貨號：CSB-E11238r-1）；IFN-γ ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER0012）；LTE-4 ELISA試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0588km）；NGF ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER0054）；兔抗大鼠TGF-β1（英國Abcam，批號：G58011）；兔抗大鼠Smad3（美國SantaCruz，批號：B58031）。

1.3 主要儀器NP-B型生物組織包埋機（Leica公司）；DMLS2型光學顯微鏡（Leica公司）；Universal HoodⅢ型凝膠成像系統（Bio-Rad公司）。

1.4 造模與分組60只SD雄性大鼠通過隨機數字表法分為對照組、模型組、布地奈德組、小青龍湯加減合二陳湯低劑量組、小青龍湯加減合二陳湯高劑量組，每組12只。適應性飼養結束后，除對照組大鼠外，其余大鼠均采用氫氧化鋁和卵清白蛋白（OA）激發聯合霧化刺激制備大鼠CVA模型[5]。分別于大鼠兩后足跖、兩腹股溝、頸部、背、腰取10點，每個點皮下注射0.05 mL新鮮配制的致敏液（1 mg卵清白蛋白+100 mg氫氧化鋁凝膠+1 mL生理鹽水），另外腹腔注射0.5 mL；第8天重復致敏1次；第15天將大鼠置于密閉有機玻璃罩內，給予含1%卵清白蛋白的生理鹽水超聲霧化激發20 min，共10 d以激發哮喘。大鼠出現明顯腹肌收縮、呼吸加快加深等呼吸道痙攣癥狀提示CVA大鼠造模成功，剔除造模失敗大鼠進行后續實驗研究，每組最終均保留10只。

1.5 實驗給藥 小青龍湯加減合二陳湯低、高劑量組大鼠分別配制含生藥濃度0.75、1.50 g/mL小青龍湯加減合二陳湯，按照1 mL/100 g劑量灌胃；布地奈德組大鼠采用等量生理鹽水配制布地奈德霧化吸入給藥，0.42 mg/kg；對照組與模型組大鼠按照1 mL/100 g生理鹽水灌胃。連續給藥2周，末次給藥1 d后處死大鼠。

1.6 觀察指標

1.6.1 ELISA法檢測血清Th1/Th2類細胞因子水平 末次給藥1 d后（禁食不禁水24 h），腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，腹主動脈取血1.5 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清IL-4、嗜酸性細胞陽離子蛋白（ECP）、人γ干擾素（IFN-γ）含量。

1.6.2 ELISA法檢測支氣管肺泡灌流液中半胱氨酰白三烯（LTE-4）、神經生長因子（NGF）水平 腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，左肺行支氣管肺泡灌洗術。分兩次進行，第一次灌入4 mL生理鹽水，第二次灌入3 mL生理鹽水，共計7 mL，并輕揉肺葉1~2 min，回收支氣管肺泡灌流液。將兩次所得的支氣管肺泡灌流液混合均勻，1 500 r/min離心5 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF含量。

1.6.3 HE染色法觀察CVA大鼠支氣管-肺組織形態 頸部脫臼法處死大鼠，經右心室插管至肺動脈，采用生理鹽水快速沖洗。取右肺中葉放入10%多聚甲醛中固定，脫水、石蠟包埋，在-20℃條件下冷藏。取平行氣道方向進行切片，制得4 μm厚的石蠟切片，HE染色，中性樹脂封片，鏡檢。

1.6.4 Western blotting法檢測支氣管-肺組織轉化生長因子β1（TGF-β1）、Smad3、糖皮質激素受體（GR）蛋白表達水平稱取50~80 mg大鼠肺組織，置于勻漿管內，加入600 μL組織裂解液提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，并將其調整至2.5 g/L。按照試劑盒要求進行上樣、電泳、轉膜、封閉，TBST洗滌，加入一抗孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗孵育30 min，TBST洗滌。將含有目的蛋白的PVDF膜轉透明玻璃板，均勻滴加現配的ECL發光液，迅速曝光，并分析圖像數據。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，重復測量資料采用重復測量方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般狀況 對照組大鼠反應靈敏、精神活潑，均未出現呼吸急促、困難等癥狀。模型組大鼠建模后出現躁動不安、打噴嚏等癥狀，之后出現呼吸急促伴輕度發紺，部分大鼠可聞喘鳴音；重復致敏后反應遲鈍、毛色失去光澤。小青龍湯加減合二陳湯低、高劑量組和布地奈德組大鼠建模后癥狀與模型組大鼠相似，給藥后大鼠呼吸急促、喘鳴音等癥狀均出現不同程度改善，但治療期間部分小青龍湯加減合二陳湯低、高劑量組大鼠出現體溫略高、飲水增多、易斗咬、激惹、食量略微下降等癥狀，考慮小青龍湯加減合二陳湯中溫燥藥物較多，大鼠出現陰液損耗等傷陰證候。但大鼠癥狀普遍較輕，在可控范圍內，不會對研究結果產生明顯影響。

2.2 各組大鼠支氣管-肺組織病理改變情況 對照組大鼠支氣管-肺組織結構完整，層次清晰，且無炎癥細胞浸潤；與對照組比較，模型組大鼠支氣管管腔狹窄，基底膜層與平滑肌層變厚，可見明顯的炎癥細胞浸潤；小青龍湯加減合二陳湯低、高劑量組和布地奈德組大鼠可見支氣管管腔相對正常，基底膜層與平滑肌層病變程度減輕，炎癥細胞浸潤減少，且小青龍湯加減合二陳湯高劑量組和布地奈德組大鼠支氣管-肺組織病理改變改善效果更佳。

圖1 各組大鼠支氣管-肺組織病理改變情況比較（HE，×200）

2.3 各組大鼠血清Th1/Th2類細胞因子水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-4、ECP水平明顯升高，IFN-γ水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，小青龍湯加減合二陳湯高劑量組和布地奈德組大鼠血清IL-4、ECP水平均明顯降低，IFN-γ水平明顯升高（P＜0.05）；小青龍湯加減合二陳湯低劑量組大鼠血清IL-4、ECP、IFN-γ水平與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；小青龍湯加減合二陳湯高劑量組大鼠血清Th1/Th2類細胞因子水平與布地奈德組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清Th1/Th2類細胞因子水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清Th1/Th2類細胞因子水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

?

2.4 各組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平比較 與對照組比較，模型組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，小青龍湯加減合二陳湯高劑量組和布地奈德組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平均明顯降低（P＜0.05）；小青龍湯加減合二陳湯低劑量組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；小青龍湯加減合二陳湯高劑量組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平與布地奈德組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平比較（±s，ng/mL）

表2 各組大鼠支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平比較（±s，ng/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

?

2.5 各組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達的比較 與對照組比較，模型組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達水平均明顯升高，GR蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，小青龍湯加減合二陳湯高劑量組和布地奈德組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達水平均明顯降低，GR蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；小青龍湯加減合二陳湯低劑量組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達水平與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；小青龍湯加減合二陳湯高劑量組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達水平與布地奈德組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表3）

表3 各組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

?

圖2 各組大鼠支氣管-肺組織中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達電泳圖

3 討 論

TGF-β1被認為是引起哮喘的主要原因，其能夠促進炎性細胞在氣道聚集并釋放大量炎性因子。同時，能夠通過Smad依賴性機制介導血管收縮蛋白內皮素-1分泌與纖連蛋白、蛋白酶、膠原蛋白表達，誘導支氣管收縮與氣道纖維化[6]。Smad蛋白是TGF-β信號通路中的重要成員，具有調控細胞合成、增殖、分化、凋亡等功效，其中Smad2、Smad3具有促進氣道肌成纖維細胞增殖的作用[7]。肌成纖維細胞增殖將導致氣道壁增厚、黏性分泌物增多，隨著以上病理改變的不斷繼續，最終將導致肺正常組織被傷痕組織取代，導致氣體交換面積減少，機體呼吸能力下降[8]。糖皮質激素類藥物是廣譜抗炎藥物，在局部呼吸道疾病治療中具有較好的療效。其抑制哮喘大鼠氣道重塑作用機制尚未完全明確，當前研究結果表明糖皮質激素類藥物可以抑制哮喘大鼠肺組織TGF-β1通路的炎癥蛋白Smad2、Smad3表達，起到改善氣道重塑病理變化的效果[9]。

祖國醫學將CVA歸于“哮病”的范疇，認為其病機在于宿痰伏肺，遇誘因引觸，以致痰阻氣道，肺失肅降。該病多由肺失清肅、寒痰伏肺所致，需治以化痰平喘、溫肺散寒之方。CVA在緩解期患者咳嗽、喘息等癥狀消失，但肺脾腎氣仍不足，需治以納氣平喘、補脾益腎之方[10]。小青龍湯出自《傷寒論》，乃治療咳喘的經典名方。組方包括麻黃、桂枝、半夏、芍藥、干姜、細辛、五味子、炙甘草，其中麻黃、桂枝可祛邪發汗解表，半夏降氣化飲，芍藥收斂營氣，干姜、細辛溫化寒飲，五味子降化水飲，甘草調和諸藥。全方融溫散、溫通、溫宣于一體，共奏止咳平喘、溫肺化痰之效。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，全方由半夏、陳皮、白茯苓、生姜、烏梅、炙甘草組成。方中半夏乃君藥，起燥濕化痰、和胃止嘔之功。輔以陳皮順氣消痰，佐以白茯苓健脾滲濕，則痰無由生。生姜化痰降逆，烏梅收斂肺氣，共助半夏行氣消痰之功。加以炙甘草調和諸藥，共奏理氣和中、燥濕化痰之效。本次研究將兩方聯用，在原方基礎上加味桃仁、地龍，減去干姜、烏梅。現代藥理學研究表明地龍有抗過敏的作用，能夠松弛支氣管平滑肌，起到較好的解痙作用。桃仁活血祛瘀，配合地龍平喘通絡、清熱定驚，全方共奏溫肺散寒、健脾祛濕之效，對應CVA痰濕蘊肺證。

CVA是免疫缺陷引起的變態反應性疾病，Th1/Th2功能失調是CVA發病機制中的重要環節。IL-4是Th2型細胞因子，具有誘導Th2分化，介導氣道炎癥發展的作用[11]。IFN-γ是Th1型細胞因子，可以誘導Th1細胞分化，并抑制Th2型細胞產生，同時可以激活單核巨噬細胞，抑制氣道炎癥發展[12]。ECP是主要的炎癥反應標志物[13]，觀察血清IL-4、ECP、IFN-γ水平變化可以在一定程度上反映機體Th1/Th2細胞平衡狀態。LTE-4可以增加毛細血管通透性，促使支氣管平滑肌收縮，誘發氣道局部炎癥，增加黏性分泌物[14]。NGF可以激活免疫系統細胞釋放炎性介質，并結合酪氨酸激酶受體（TrkA）增加神經元興奮性，并誘導神經肽表達，引起氣道平滑肌收縮，加重氣道炎癥[15]。二者均是CVA的重要炎性介質，可以直接反映氣道炎癥程度，在CVA臨床治療中具有重要的診斷價值。本研究表明CVA發生后大鼠肺組織會發生一系列病理改變，主要表現為基底膜層、平滑肌層變厚與炎癥細胞浸潤，提示在CVA發生與進展中炎癥反應是導致氣道重塑的主要原因。CVA大鼠血清IL-4、ECP含量升高，IFN-γ含量降低，提示CVA大鼠Th1/Th2功能失調，機體炎癥反應不斷擴大。支氣管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平上調，提示CVA大鼠肺組織炎癥損傷加重。觀察CVA大鼠支氣管-肺組織TGF-β1、Smad3、GR蛋白表達情況可見TGF-β1、Smad3蛋白表達水平顯著提高，GR蛋白表達水平顯著下降。研究[16-17]表明，TGF-β1受體在抑制TGF-βR1/Smad2/Smad3通路表達的同時還能促進Acvr11、Smad1/Smad5/Smad8通路表達，降低氣道上皮細胞Smad2蛋白磷酸化，同時減少TGF-βR1/Smad2/Smad3依賴性膠原蛋白與彈性蛋白沉積，避免氣道纖維化損傷。提示TGF-βR1/Smad3是改善哮喘氣道重構的重要靶點。糖皮質激素類藥物作用機制在于糖皮質激素與配體GR相結合，將去乙酰化酶-2募集至激活的炎癥基因轉錄復合物逆轉激活的炎癥基因組蛋白乙酰化，抑制哮喘患者上皮細胞多種炎癥基因表達[18]。其中GR可以募集共調節因子并調控轉錄機制，發揮關鍵性的調節作用，提示GR是通過調節炎癥治療哮喘的重要靶點。根據以上研究結果推測，GR介導TGF-β1/Smad3信號通路在抑制CVA中起到了關鍵作用。給予CVA大鼠小青龍湯加減合二陳湯治療后，大鼠支氣管-肺組織病理改變程度明顯減輕，TGF-β1、Smad3蛋白表達水平下降，GR蛋白水平升高，提示小青龍湯加減合二陳湯治療CVA的作用機制可能在于上調GR蛋白表達，并由GR介導TGF-β1/Smad3信號軸，下調TGF-β1、Smad3蛋白表達水平，從而抑制炎性細胞因子產生，起到減輕CVA疾病癥狀的效果。

綜上所述，小青龍湯加減合二陳湯可以改善CVA大鼠肺組織病變，抑制機體炎癥反應，其具體作用機制可能與GR介導TGF-β1/Smad3信號軸有關。