食品中乳酸桿菌的實時熒光PCR 的快速檢測運用

齊越

通遼市食品藥品檢驗所食品室 內蒙古通遼 028000

乳酸桿菌大量存在于各種乳制品中，常見的有保加利亞乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌和乳酪乳桿菌等，這些乳酸桿菌可以被用來食品發酵和生物檢定，但是一些乳酸桿菌尤其是乳桿菌也可能成為物質腐爛的主要細菌之一。在微生物種類檢定中，常用高度保守性的16S rDNA 序列進行檢定，本文針對含有酒花物質的啤酒，利用實時熒光PCR 技術對啤酒中的乳酸桿菌進行檢測和控制，設計通用引物和特異性探針，驗證該技術方法在乳酸桿菌的檢定中具有高度特異性、靈敏度和快速簡便的特征。

1 試驗材料和試驗方法

1.1 原材料

本試驗選擇植物乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌開展試驗，所有菌種均從實驗室分離得到[1]。

1.2 試驗設備和試劑

本試驗研究選擇實時熒光PCR 基因擴增設備、臺式高速離心機、恒溫振蕩設備和厭氧罐作為試驗設備，選擇MRS 等培養基，以及細菌基因組DNA 提取試劑盒等試劑。

1.3 試驗方法和試驗步驟

首先第一步，在培養基中進行細菌培養，然后從試劑中提取基因組DNA，要求在有氧和厭氧的條件下分別培養菌種，以37℃的溫度恒溫培養48 小時后提取細菌。第二步，設計實時熒光PCR通用引物和特異性探針，即針對16S rDNA 序列同源性通用比較和非同源性參考菌株的特異性檢測，在同源性較高的地方設計乳酸桿菌通用性引物和探針。第三步，將乳酸桿菌菌株稀釋到不同的梯度后，在不同的反應溫度和時間下開展靈敏度檢測。具體檢測步驟包括：將乳酸桿菌標準菌株放置于相應的培養基中培養一段時間，然后檢測其靈敏度值，估計菌株的數量，然后按照不同梯度進行稀釋，取最后幾個梯度的菌株液涂平板計數，如此循環多次后取平均值確定最后的菌密度，將每一個梯度的菌株液體各取3 管開展實時熒光PCR 檢測，并將檢測的結果和平板計數結果相對照，以確定反應菌株的靈敏度情況。最后第四步開展特異性檢測，即將乳酸桿菌標準菌株、大腸桿菌、沙門氏菌、黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、弗氏志賀菌分別放置在菌液中培養并提取細菌DNA，將以上幾種細菌的DNA 混合后再進行實時熒光PCR 檢測，可檢測非同源性參考菌株的特異性[2]。

2 試驗結果和分析

2.1 靈敏度檢測結果

將植物乳酸桿菌菌株按照一定的梯度進行稀釋以后，采用實時熒光PCR 進行檢測，根據平板計數可得到檢測的濃度是83CFU/mL。將干酪乳桿菌按照同樣的倍數和方法稀釋以后，再利用實時熒光PCR 進行檢測，根據平板計數的結果可得到最終檢測的濃度是100CFU/ml。針對保加利亞乳酸桿菌的靈敏度檢測，按照1-7的倍數進行稀釋后，再利用實時熒光PCR 檢測，根據平板計數結果檢測得到的濃度是40CFU/ml。

2.2 特異性試驗結果

從非同源性參考菌株的實時熒光PCR 特異性檢測結果可知，乳酸桿菌得到了擴增，所有非乳酸桿菌沒有檢測到熒光信號，說明實時熒光PCR 在檢測乳酸桿菌的方面具有較好的特異性[3]。

3 試驗結果討論

從上文對食品中乳酸桿菌的實時熒光PCR 檢測分析可知，利用厭氧培養法和平板計數是常見的檢測方法，在培養基中培養出試驗所需的菌株以后，可直接肉眼觀察初步分析結果。乳酸桿菌的細胞呈多樣化多形態，有細長狀、彎曲狀和短桿狀等，其一般處于靜止狀態，無芽孢。采用厭氧平板法檢測時間較長，往往需要一周甚至更久才能觀測到結果，這樣就無法及時反映微生物是否具有污染特性且污染的嚴重性。對于乳酸桿菌而言，其在形成的過程中對營養的要求比較高，培養特性特殊，無法使用傳統平板培養法進行培養，而且后期分離這些培養菌株也需要一定的時間。因此，需要采用更加快速高效且靈敏度更高的針對乳酸桿菌的培養、檢測檢驗方法。PCR 檢測法在一開始在應用時，存在假陽性污染與定量分析和準確度不高的問題，這些年來開始采用實時PCR 熒光定量檢測技術，該技術方法的使用不但可以進行乳酸桿菌的定量檢測還能進行定性分析，特異性和靈敏度較高，且定量檢測更加準確、速度更快，定性分析也更加精準，將其用在分子生物學檢定實驗中具有突出的優勢。

本文針對食品中的乳酸桿菌，針對16S rDNA 序列設計了擴增乳酸桿菌通用引物和非同源性菌株特異性檢測試驗。在采用實時熒光PCR 檢測時，采用乳酸桿菌通用引物出現了特異性擴增，而非乳酸桿菌沒有出現特異性擴增。這說明所采用的乳酸桿菌引物和探針都具有較高的特異性，并且只特異性擴增了乳酸桿菌。

4 結語

綜上所述，隨著對食品質量和食品安全的高度重視，提高食品質量檢測的速度、效率和效果已經勢在必行。在對食品乳酸桿菌檢測方面，常規檢測方法不僅效率不高而且檢測結果的精確性較低，檢測時間較長無法很準確反映微生物的污染情況。為此，本試驗設計了采用實時熒光PCR 檢測食品中乳酸桿菌的方法，提高了檢測的質量可靠性和準確性，且能在較短的時間內反映污染物的特性，實用性和時效性較強，將其應用在生物分析鑒定中具有十分廣闊的應用發展前景，為乳酸桿菌的試驗檢測技術和理論的發展奠定良好基礎。