19個(gè)X-STR熒光復(fù)合擴(kuò)增體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)估

林添春?楊幸怡?熊晨?李?yuàn)W成?孫宏鈺?劉超

【摘要】目的 評(píng)估含有19 個(gè)X染色體-短串聯(lián)重復(fù)序列（X-STR）的復(fù)合擴(kuò)增體系在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用效果。方法 參照DNA分析方法科學(xué)工作組（SWGDAM）的驗(yàn)證指南，評(píng)估了含有19 個(gè)X-STR的復(fù)合擴(kuò)增體系的種屬特異性、靈敏度、抗抑制劑、精確性、可重復(fù)性、一致性、在混合樣本與陳舊樣本中的檢測(cè)效果及stutter峰和群體多態(tài)性。結(jié)果 DNA 模板量在0.25～1.00 ng 時(shí)，各基因座分型結(jié)果清晰準(zhǔn)確，均衡性好、特異性強(qiáng)，混合、陳舊樣本均能獲得正確的分型結(jié)果;檢測(cè)中國(guó)南方漢族共196份無(wú)關(guān)個(gè)體血樣，19個(gè)X-STR遺傳標(biāo)記共檢出151個(gè)等位基因，基因頻率為0.0037 ～ 0.8439，其中多態(tài)性信息量最為豐富的基因座是DXS10135（多肽性信息含量= 0.9173），個(gè)體識(shí)別能力在男、女性群體中分別為0.9124、0.9894;累積個(gè)體識(shí)別能力在男性群體中大于0.999 999 999 874，在女性群體中大于0.999 999 999 999;在三聯(lián)體案件中的累積平均排除概率大于0.999 999 999 298，在二聯(lián)體中的累積平均排除概率大于0.999 999 500 495。結(jié)論 含有19 個(gè)X-STR的復(fù)合擴(kuò)增體系分型準(zhǔn)確、穩(wěn)定，滿足法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的要求，獲得的基因頻率等參數(shù)可為X-STR檢驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支撐。

【關(guān)鍵詞】X染色體-短串聯(lián)重復(fù)序列;熒光復(fù)合擴(kuò)增;法醫(yī)遺傳學(xué);驗(yàn)證

Forensic evaluation of 19 X-STR fluorescent multiplex amplification system systems Lin Tianchun， Yang Xingyi， Xiong Chen， Li Aocheng， Sun Hongyu， Liu Chao. Department of Forensic Medicine， Zhongshan Medical College， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510089， China Corresponding author， Sun Hongyu， E-mail： sunhongyu2002@163.com; Liu Chao， E-mail： liuchaogzf@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the forensic performance of 19 X-STR fluorescent amplification system. Method Referring to the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods （SWGDAM）， the detection effect of the specificity， sensitivity， inhibitor resistance， repeatability， compatible consistency， stutter and population polymorphism of the system in the mixed and degraded samples was evaluated. Results When the DNA template was between 0.25 and 1.00 ng， the typing results of each locus were distinctly accurate， well balanced and with strong specificity. Correct typing results could be obtained in both mixed and degraded samples. Blood samples of 196 unrelated Han nationality individuals from southern China were collected， and 151 allele profiles were detected from 19 X-STR loci. The gene frequency was detected between 0.0037 and 0.8439. DXS10135 （PIC = 0.9173） was the most polymorphic locus， with discrimination power （DP） of 0.9124 and 0.9894 for the male and female; The total discrimination power （TDP） was greater than 0.999 999 999 874 in the male. and greater than 0.999 999 999 999 in the female; The mean exclusion chance （MEC） in the DNA triplet was higher than 0.999 999 999 298， and greater than 0.999 999 500 495 in the duo cases. Conclusions The 19 X-STR fluorescent amplification system is distinctly accurate and stable， which can fulfill the requirement of forensic application. The gene frequency and other parameters can be provide data support for X-STR testing.

【Key words】X-Chromosome Short Tandem Repeat; Fluorescent multiplex amplification;Forensic genetics; Validation

常染色體及Y染色體-短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）已經(jīng)常規(guī)用于司法鑒定，但是X染色體-STR（X-STR）基因座的應(yīng)用研究相對(duì)較少[1]。X染色體具有獨(dú)特的遺傳特性：母親可以傳遞給子女，而父親僅傳遞給女兒且該染色體來(lái)自女兒的祖母，可作為常染色體多態(tài)性分析的重要補(bǔ)充，在復(fù)雜親緣鑒定、男女混合樣本檢測(cè)以及部分倫理犯罪中有特殊的應(yīng)用價(jià)值[2]。本研究選擇的MicroreaderTM 19 X-STR復(fù)合擴(kuò)增體系（MRX19），遺傳標(biāo)記均分布在非連鎖簇內(nèi)，遺傳標(biāo)記間的遺傳距離相距較遠(yuǎn)，符合獨(dú)立遺傳，但該復(fù)合擴(kuò)增體系群體多態(tài)性報(bào)道少，尚未見(jiàn)法醫(yī)應(yīng)用評(píng)估報(bào)道。為此，研究收集了196份無(wú)關(guān)個(gè)體血樣，檢測(cè)了19個(gè)X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）及性別基因座，評(píng)估了該熒光復(fù)合擴(kuò)增體系的種屬特異性、靈敏度、抗抑制劑、精確性、可重復(fù)性、一致性與在混合樣本、陳舊檢材中應(yīng)用效果及影子峰（Stutter峰）和群體多態(tài)性，并優(yōu)化了擴(kuò)增條件，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、樣 本

種屬特異性實(shí)驗(yàn)：選取倉(cāng)鼠、狗、猴子、雞、龍貓、貓、牛、猩猩、鴨、羊非人源DNA各0.5 ng，均來(lái)源于廣州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所的科研積累。

抗抑制劑實(shí)驗(yàn)：將不同濃度的法醫(yī)實(shí)踐常見(jiàn)的抑制劑[血紅素、靛藍(lán)、腐殖酸、乙二胺四乙酸（EDTA）]加入到0.5 ng的9947A中。血紅素的濃度梯度為0、75、125、150 μmol/L;靛藍(lán)的濃度梯度為0、750、1500、2000 μmol/L;腐殖酸的濃度梯度為0、5、10、20 ng/μL;EDTA的濃度梯度為0、0.8、1.0、1.2 mmol/L。

男/女混合樣本：通過(guò)混合標(biāo)準(zhǔn)品2800M和標(biāo)準(zhǔn)品9947A來(lái)實(shí)現(xiàn)的。分別按照1∶1、1∶4、1∶9、1∶19、19∶1、9∶1、4∶1 和1∶1的比例混合，每份混合樣本的DNA總量均為1 ng。

分型一致性、陳舊檢材實(shí)驗(yàn)的樣本：來(lái)源于日常檢案積累。

群體樣本：根據(jù)知情同意原則，收集來(lái)自廣東、廣西、湖南及江西省的196份（男性樣本123份，女性樣本73份）中國(guó)南方漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的血樣。本實(shí)驗(yàn)涉及到生物實(shí)驗(yàn)等有關(guān)設(shè)計(jì)、實(shí)施方案及受試者征集過(guò)程符合中山醫(yī)學(xué)院倫理原則（倫理批件號(hào)：中山醫(yī)醫(yī)倫[2020]第044號(hào)）。

二、主要試劑和儀器

主要試劑包括MicroreaderTM 19 X ID 熒光檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的QD550內(nèi)標(biāo)（購(gòu)自閱微公司）、AGCUX19 STR熒光檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的SIZ-500內(nèi)標(biāo)（購(gòu)自中德美聯(lián)公司）和BK-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（購(gòu)自博坤生物科技有限公司）[3]。主要儀器包括BK-TQ-001E 博坤全自動(dòng)DNA提取工作站、Qubit?2.0 Fluorometer定量?jī)x、ABI 9700型擴(kuò)增儀、ABI 3500全自動(dòng)遺傳分析儀、ABI 3500XL全自動(dòng)遺傳分析儀和ABI 3130XL全自動(dòng)遺傳分析儀。

三、方 法

1. DNA提取

前述所有樣本采用BK-超微量磁珠法DNA提取試劑盒通過(guò)BK-TQ-001E全自動(dòng)工作站提取基因組DNA，模板DNA均使用Qubit?2.0 Fluorometer定量?jī)x進(jìn)行濃度測(cè)定[4]。

2. DNA擴(kuò)增

參照DNA分析方法科學(xué)工作組（SWGDAM）的驗(yàn)證指南，評(píng)估MRX19的種屬特異性、靈敏度、抗抑制劑性、精確性、可重復(fù)性、一致性與在混合樣本、陳舊樣本中的檢測(cè)效果及stutter峰和群體多態(tài)性[5]。其中特異性、靈敏度、分型一致性、混合樣本、陳舊檢材實(shí)驗(yàn)均使用25.0 μl體系：PCR反應(yīng)液10.0 μL，引物混合液5.0 μL，MicroreaderTM Tap DNA PolymeraseⅡ 0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，擴(kuò)增水8.5 μL。PCR擴(kuò)增使用ABI 9700型擴(kuò)增儀，擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：變性95℃ 2 min，熱循環(huán)94℃5 s，60℃ 70 s，29個(gè)循環(huán)，終延伸60℃30 min，4℃保溫。

3. 電泳與分型

通過(guò)ABI 3130XL遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，樣品制備：1.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與9.0 μL上樣緩沖液混合。上樣緩沖液包含8.5 μL Hi-Di甲酰胺以及0.5 μL內(nèi)標(biāo)。X-STR基因分型通過(guò)GeneMapperID-X軟件完成，包括19個(gè)X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0對(duì)男、女群體之間各基因座的等位基因頻率分布差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Arlequin 3.5對(duì)女性樣本分型數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg（H-W）平衡檢驗(yàn)和各基因座間進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)。使用在線X-STR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.chrx-str.org/）計(jì)算該19個(gè)X-STR的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)。通過(guò)收集19個(gè)X-STR熒光檢測(cè)體系A(chǔ)llelic Ladder電泳的16個(gè)通道的電泳數(shù)據(jù)計(jì)算每個(gè)等位基因片段的電泳遷移率。Stutter比率為Stutter峰高與相應(yīng)等位基因峰高的比值。α = 0.05，多重比較采用Bonferroni法。

結(jié)果

一、種屬特異性驗(yàn)證

檢測(cè)猩猩、猴子、牛、羊、狗、雞、鴨、龍貓、貓和倉(cāng)鼠的樣本，除猩猩的樣本檢測(cè)到非特異性擴(kuò)增片段之外，其它物種均未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段。

二、靈敏度實(shí)驗(yàn)

使用9947A梯度稀釋模板量分別為1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.0312 50 ng進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。19個(gè)X-STR完整分型的最低模板量為0.25 ng。

三、抗抑制劑實(shí)驗(yàn)

血紅素、靛藍(lán)、腐殖酸和EDTA 4種抑制劑對(duì)該檢測(cè)系統(tǒng)檢出完整等位基因分型干擾濃度分別為125 μmol/L、750 μmol/L、5 ng/μL、0.8 mmol/L。

四、精確性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)使用3500XL遺傳分析儀（容忍范圍0.50 bp）上電泳24份等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物并統(tǒng)計(jì)片段遷移率，雖然基因座DXS7423和HPRTB表現(xiàn)出較大遷移率，但是兩者的遷移率均在0.20 bp之內(nèi)，沒(méi)有超出遺傳分析儀的容忍范圍，見(jiàn)圖1。

五、可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

不同組織男、女樣本各1份，分別使用3臺(tái)不同儀器（3500、3500XL、3130XL）進(jìn)行電泳檢測(cè)，每組重復(fù)3次，均得到一致結(jié)果，峰高均在1500 rfu以上。

六、一致性實(shí)驗(yàn)

196份群體樣本中與AGCU 19X STR試劑盒共有的7個(gè)基因座（DSX10079、DXS101、DXS10135、DXS10162、DXS6809、DXS7423、HPRTB）均得出相同的基因分型。

七、混合樣本實(shí)驗(yàn)

通過(guò)混合標(biāo)準(zhǔn)品2800M和標(biāo)準(zhǔn)品9947A進(jìn)行檢驗(yàn)，在1∶1混合的樣本中檢出完整基因分型，但小于或等于1∶4時(shí)，DNA含量低的樣本出現(xiàn)遺傳標(biāo)記丟失，丟失的片段主要為長(zhǎng)片段。

八、陳舊檢材實(shí)驗(yàn)

選取12份陳舊血樣，同步使用MRX19與AGCU X19試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。12份樣本所有基因座全部得到完整分型，表明MRX19檢出效能較高，并與AGCU X19熒光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，分型結(jié)果一致。

九、PCR優(yōu)化

1. 循環(huán)數(shù)梯度

使用25 μL體系對(duì)0.5 ng 9947A進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置5個(gè)循環(huán)數(shù)目梯度，分別為27、28、29、30 和31。熒光峰值隨著循環(huán)數(shù)的增加而升高，循環(huán)數(shù)為27時(shí)可以得到完整基因分型，樣本在29個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)時(shí)，各基因座擴(kuò)增的熒光均衡性更好，而當(dāng)循環(huán)數(shù)超過(guò)30時(shí)由于熒光峰值過(guò)高，個(gè)別基因座出現(xiàn)熒光滲透現(xiàn)象，影響相同片段大小的其他等位基因的分型。

2. 退火溫度梯度

以56、58、60、62、64 ℃的5個(gè)溫度梯度對(duì)體系的退火溫度耐受性進(jìn)行測(cè)試，均能得到完整的基因分型，且60 ℃時(shí)產(chǎn)物片段熒光峰值和特異性最好，除64 ℃時(shí)DXS6807基因座雜合子峰高比為0.207，其余溫度時(shí)該體系14個(gè)基因座的雜合子峰高比均在0.6～1.0，均衡性較好，見(jiàn)圖2。

3. 終延伸時(shí)間梯度

取0、15、30、45、60 min 5個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)延伸時(shí)間高于15 min時(shí)，目的峰沒(méi)有減A峰出現(xiàn)，高于30 min時(shí)處于穩(wěn)定，因此該體系最佳延伸時(shí)間設(shè)置為30 min。

十、Stutter峰研究

統(tǒng)計(jì)了50個(gè)南方漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的樣本數(shù)據(jù)從而得出每個(gè)基因座的Stutter范圍并進(jìn)一步加權(quán)分析后算出Stutter峰值，結(jié)果顯示19個(gè)X-STR基因座的Stutter峰平均比率均低于15%。

十一、群體多態(tài)性檢測(cè)

檢測(cè)196份無(wú)關(guān)個(gè)體19個(gè)X-STR基因座均符合H-W平衡（P > 0.05/19），且19個(gè)X-STR基因座相互之間未出現(xiàn)連鎖不平衡狀態(tài)（P > 0.05/171）。雜合度觀察值（Ho）為0.3151～0.9178，雜合度期望值（He）為0.2927～0.9249，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.2633～0.9173，其中PIC最為豐富的基因座為DXS10135。此外，DXS10135、DXS10079、DXS6809、DXS10162、DXS981、GATA31E08、DXS101等7個(gè)基因座的PIC均大于0.7。另外，男性群體中的累積個(gè)體識(shí)別能力（TDP）大于0.999 999 999 874，女性群體中的TDP大于0.999 999 999 999。累積平均排除概率（MEC）在三聯(lián)體案件中大于0.999 999 999 298，在二聯(lián)體案件中大于0.999 999 500 495。共檢出151個(gè)等位基因，基因頻率分布在0.0037～0.8439之間。等位基因數(shù)目最多的DXS10135檢出21個(gè)等位基因，等位基因數(shù)目最少的DXS7423僅有4個(gè)等位基因被檢出，見(jiàn)表1。

討論

本研究參照SWGDAM的驗(yàn)證指南，對(duì)MRX19進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)估。種屬特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅來(lái)源于猩猩DNA的樣本出現(xiàn)了非特異擴(kuò)增片段，而其他樣本均未出現(xiàn)擴(kuò)增片段，表明該體系具有較好的種屬特異性。該體系在模板量大于等于0.025 ng可獲得完整分型，顯示靈敏度高。12份陳舊、微量檢材全部得到完整基因分型，顯示該體系可用于案件檢材。在抗抑制試驗(yàn)中，加入法醫(yī)實(shí)踐中常見(jiàn)的抑制物血紅素、靛藍(lán)、EDTA等，結(jié)果顯示該體系對(duì)抑制劑有較好的耐受性。

PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該體系在循環(huán)數(shù)為27的PCR體系中可以得到完整基因分型，循環(huán)數(shù)為29時(shí)各基因座擴(kuò)增均衡性最佳，而當(dāng)循環(huán)數(shù)超過(guò)30時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光滲透現(xiàn)象。退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，該體系在56～64℃均能得到完整的基因分型， 60℃時(shí)PCR效率最高，即產(chǎn)物片段熒光峰值和特異性最好。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為該擴(kuò)增體系在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)一步優(yōu)化提供了借鑒。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，由于X-STR特有的遺傳特征，常被作為重要的技術(shù)手段應(yīng)用于復(fù)雜親權(quán)鑒定及男女混合樣本檢測(cè)。然而目前應(yīng)用的X-STR檢測(cè)試劑盒主要為德國(guó)Qiagen公司基于國(guó)外人群數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的試劑盒，可檢出12個(gè)X-STR遺傳標(biāo)記，遺傳標(biāo)記數(shù)目少，集中在4個(gè)連鎖簇內(nèi)，除了價(jià)格較高以外該試劑盒檢測(cè)中國(guó)人群基因多態(tài)性的靈敏度較低[6]。因此，研發(fā)基于中國(guó)人群基因多態(tài)性的新型X-STR試劑盒有非常重要的意義。中德美聯(lián)的AGCU X19熒光檢測(cè)體系能檢測(cè)19個(gè)X-STR，優(yōu)勢(shì)為位點(diǎn)較多，經(jīng)過(guò)應(yīng)用驗(yàn)證并獲得較多中國(guó)群體法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)，能比較清晰了解其中的連鎖重組關(guān)系，基因座主要分布在7個(gè)連鎖簇內(nèi)，計(jì)算復(fù)雜親緣關(guān)系時(shí)可以更精準(zhǔn)地計(jì)算似然率值[7-8]。本次研究的196份樣本中，MRX19與AGCU X19熒光檢測(cè)體系在共有的7個(gè)基因座獲得相同的基因分型，提示MRX19分型準(zhǔn)確性高。MRX19的優(yōu)勢(shì)是X-STR基因座間遺傳距離較遠(yuǎn)，基本認(rèn)為獨(dú)立遺傳，在本次實(shí)驗(yàn)中使用女性樣本的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示所有基因座的組合均未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡狀態(tài)（P均 > 0.05/171），表明該群體在此19個(gè)X-STR基因座的等位基因頻率及基因型頻率處于遺傳平衡狀態(tài)，內(nèi)部各基因座的遺傳是相互獨(dú)立的。

另外，MRX19體系全部19個(gè)X-STR基因座的男、女性等位基因分布比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故將男女性進(jìn)行合并計(jì)算。女性樣本的所有基因座均符合H-W平衡。該體系的累積個(gè)體識(shí)別能力在男性群體中大于0.999 999 999 874，在女性群體中大于0.999 999 999 999;在三聯(lián)體案件中的累積平均排除概率大于0.999 999 999 298，在二聯(lián)體中的累積平均排除概率大于0.999 999 500 495，結(jié)果表明該檢測(cè)體系具有良好的多態(tài)性，單獨(dú)使用這套遺傳標(biāo)記可以獲得較高的個(gè)體識(shí)別率;配合連鎖簇內(nèi)的X-STR遺傳標(biāo)記使用，在計(jì)算復(fù)雜親緣關(guān)系時(shí)可獲得更高的準(zhǔn)確性，該體系適用于法醫(yī)個(gè)體識(shí)別及補(bǔ)充復(fù)雜親緣關(guān)系的鑒定。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-02-20）

（本文編輯：林燕薇）