基于網絡藥理學的雞血藤抗肝纖維化機制研究▲

黃菊芳 蔣云霞 黎敏航 羅 婷 羅偉生

(1 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內科，南寧市 530011，電子郵箱：huang18376785146@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧市 530001)

肝纖維化是在病毒性肝炎、乙醇、自身免疫以及藥物等各種致病因子作用下引起的肝內慢性損傷和炎癥[1]，可導致細胞外基質在肝臟內過度沉積，是各種慢性肝病發(fā)展的病理特征。肝纖維化的發(fā)展具有隱匿性，有效控制肝纖維化對預防肝硬化和肝癌具有重要作用。然而當前臨床上仍然缺乏高效且無明顯毒副作用的抗肝纖維化西藥專藥，故從中醫(yī)藥寶庫中尋找有效抗肝纖維化的藥物具有重要的意義。

雞血藤為豆科木質藤本植物密花豆的干燥藤莖，記載于《本草綱目拾遺》，其性苦、甘、溫，歸肝、腎兩經，具有活血補血，調經止痛，舒筋活絡功效[2]。研究表明，雞血藤具有抗氧化、降血脂、保護肝細胞、抗病毒等作用[3-5]，但是目前有關雞血藤用于抗肝纖維化的研究較少，且抗肝纖維化的分子作用機制尚不明確。本文擬采用網絡藥理學探討雞血藤抗肝纖維化的作用機制。

1 資料和方法

1.1 篩選雞血藤的活性成分 借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索雞血藤的所有化學成分，然后以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[6]，篩選雞血藤中的活性成分。然后利用 Perl 軟 件(https://www.perl.org/)對篩選出的活性成分的靶點進行預測。

1.2 注釋雞血藤的靶點基因 針對1.1中篩選出的靶點，利用UniProt在線蛋白質數(shù)據庫(https://www.uniprot.org/)查找對應的標準靶點基因名，從而對雞血藤的靶點基因進行注釋，刪除UniProt數(shù)據庫中未查詢到基因名的靶點。

1.3 篩選雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點 以“Liver fibrosis”為檢索詞，通過GeneCards數(shù)據庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據庫(https://www.genecards.org/)檢索疾病靶點，從而得到肝纖維化的疾病靶點。利用微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)構建韋恩圖，從而將疾病靶點與篩選出來的雞血藤活性成分靶點進行比對并取交集，最終獲得雞血藤作用于肝纖維化的潛在作用靶點。

1.4 構建藥物-疾病靶點網絡 通過Cytoscape 3.7.0軟件構建雞血藤活性成分-肝纖維化靶點網絡，運用Cytoscape插件Network Analyzer計算網絡的拓撲參數(shù)，設置節(jié)點的形狀、大小以及顏色透明度，根據節(jié)點和節(jié)點之間的作用強度調節(jié)邊的粗細，并得到網絡分析結果。

1.5 構建雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點的蛋白-蛋白互作網絡 將雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點導入在線軟件STRING 11.0，設定研究物種為“homo sapiens”，下載“string_interactions.tsv”文件，并將信息導入Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化分析處理，構建蛋白-蛋白互作(protein-protein,interaction,PPI)網絡圖。其中，度值(Degree)反映節(jié)點的中心屬性，即靶點的顏色越深、面積越大，則度值越高；連線的粗細表示節(jié)點與節(jié)點之間的相互作用，線條越粗則代表節(jié)點之間的關系越密切。

1.6 基因功能和通路富集分析 利用DAVID數(shù)據庫(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，針對雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點進行基因本體論(Gene Ontology,GO)生物學功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,根據P≤0.01篩選出前10名GO生物學功能和KEGG通路。利用R語言軟件構建KEGG通路分析的柱狀圖。

2 結 果

2.1 雞血藤的主要活性成分 共搜索到雞血藤有效成分68個，相關靶點1 142個。根據OB≥30%、DL≥0.18的標準去重篩選，共獲得主要活性成分24個，對應的靶點56個。見表1。

表1 雞血藤的主要活性成分

2.2 雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點 基于GeneCards和OMIM數(shù)據庫，通過篩選去重得到肝纖維化的疾病靶點共6 899個，將雞血藤主要活性成分的靶點與肝纖維化的疾病靶點取交集，獲得共同的靶點49個(見圖1)，包括孕激素受體(progesterone receptor,PGR)、毒蕈堿膽堿能受體(cholinergic receptor muscarinic,CHRM)3、CHRM1、CHRM2、γ-氨基丁酸A型受體α1亞單位(gamma-aminobutyric acid type A receptor subunit alpha 1,GABRA1)、乙醇脫氫酶1B(Ⅰ類)β多肽[alcohol dehydrogenase 1B(classⅠ),beta polypeptide,ADH1B]、前列腺素內過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、腎上腺素受體α1A(adrenoceptor alpha 1A,ADRA1A)等靶點。

圖1 雞血藤-肝纖維化共同靶點的韋恩圖

2.3 藥物-疾病靶點網絡 將24個雞血藤有效活性成分以及49個雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點，構建藥物-疾病靶點網絡(見圖2)。該網絡中共有74個節(jié)點通過219條邊發(fā)生作用，其中包括23個雞血藤主要活性成分節(jié)點(藍色箭頭)和49個肝纖維化的疾病靶點基因節(jié)點(紫色圓形)、疾病(橘色四邊形)、中藥(紫色三角形)。

圖2 雞血藤活性成分-肝纖維化疾病靶點網絡圖

2.4 蛋白互作網絡與核心基因篩選結果 將雞血藤有效活性成分作用于肝纖維化的靶點導入在線軟件STRING 11.0，獲取蛋白互作數(shù)據，并利用Cytoscape 3.7.0軟件根據度值的大小進行排列，構建PPI網絡(見圖3)，此網絡共有48個節(jié)點(雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點)通過319條邊進行相互作用。其中，雞血藤抗肝纖維化的潛在靶點度值排前5的靶點依次為表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)、癌組基因(MYC)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、雌激素受體(estrogen receptor,ESR)1和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)。利用Cytoscape軟件分析插件Node Degree Distribution，對雞血藤對肝纖維化作用靶點的PPI網絡進行拓撲學分析，取靶點度值前30的靶點，見表2。

圖3 PPI網絡圖

表2 PPI網絡拓撲學分析結果(Degree排前30的靶點)

2.5 雞血藤作用于肝纖維化的生物信息學分析 GO功能富集分析結果提示，雞血藤作用于肝纖維化的有效靶點參與了154個生物學過程,包括凋亡過程負調控、細胞對缺氧的反應、細胞增殖等；23個細胞成分，包括細胞核、突觸、核漿、細胞質等；46個分子功能，包括類固醇激素受體活性、類固醇結合、半胱氨酸型內肽酶活性與細胞凋亡的關系等。見表3。

表3 雞血藤對肝纖維化作用靶點的GO分析

共分析出101條信號轉導通路，前20條通路見圖4，其中包括前列腺癌信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路、乙型肝炎信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號通路、EB病毒感染信號通路、膀胱癌信號通路等。

圖4 KEGG通路分析柱狀圖

3 討 論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病的共同表現(xiàn)，是肝硬化以及肝癌必經的中間環(huán)節(jié)，嚴重危害人類健康。研究表明，中醫(yī)藥在預防和抗肝纖維化中起到了一定的成效，單味中藥的提取物如莪術醇[7]、姜黃素[8]、川芎嗪[9]等都可通過不同的靶點或信號通路抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，從雞血藤中可提取到黃酮類、酚酸、香豆素、木脂素、萜、生物堿和甾體等活性成分[10-11]，這些活性成分可通過促進肝腫瘤細胞凋亡[12]、抑制氧化應激[13]起到保護肝臟的作用。但是目前有關雞血藤抗肝纖維化作用的研究較少，且雞血藤含有多種活性成分，其抗肝纖維化的主要成分及抗肝纖維化的作用機制尚不完全明確。本研究利用網絡藥理學對雞血藤抗肝纖維化的作用機制進行探討，以期闡釋雞血藤防治肝纖維化的主要成分及其作用靶點，為尋找和開發(fā)抗肝纖維化的藥物提供參考。

本研究通過網絡藥理學分析，得出雞血藤的主要活性成分24個和潛在的抗肝纖維化靶點49個；PPI網絡中度值排前5位的靶點依次為EGFR、MYC、IL-6、ESR1和VEGFA，其與其他靶點發(fā)生的相互作用最多，提示這5個靶點是雞血藤抗肝纖維化的有效潛在靶點。研究表明，細胞因子通過刺激肝星狀細胞的活化和增生，抑制細胞外基質的降解，導致肝纖維化進一步發(fā)展[14]。其中，表皮生長因子受體屬于受體酪氨酸激酶的ErbB家族，在上皮細胞生理學中發(fā)揮關鍵作用，是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導的受體[15]。EGFR的表達升高與肝組織損傷和炎癥反應延長有密切的聯(lián)系[16]，并參與肝纖維化的形成和發(fā)展[17]。MYC基因包括C-myc、N-myc、L-myc 3個家族成員[18]，C-myc在肝細胞中會誘導肝星狀細胞的激活，促進成肌纖維細胞分化增殖[19]，是慢性肝臟疾病的驅動力[20]，可導致肝纖維化甚至肝硬化和肝腫瘤發(fā)生。雞血藤的有效活性成分可能主要通過調節(jié)上述肝細胞有害因子以及肝組織炎癥反應(細胞因子)等來抑制肝纖維化的進展。目前，尚無文獻報告IL-6、ESR1、VEGFA與肝纖維化的關系。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，雞血藤抗肝纖維化潛在的靶點主要參與凋亡過程負調控、細胞對缺氧的反應、細胞增殖等生物學過程，涉及細胞質、突觸、核漿、細胞核等細胞成分，以及類固醇激素受體活性、類固醇結合、半胱氨酸型內肽酶活性與細胞凋亡的關系等分子功能；這些靶點可通過影響甾體激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結合、核受體的活性、乙酰膽堿受體的活性、泛素蛋白連接酶結合、突觸后神經遞質受體活性、DNA結合轉錄因子的結合等過程來調控肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

KEGG通路分析結果顯示，雞血藤抗肝纖維化潛在的靶點涉及的信號通路主要包括前列腺癌信號通路、人類巨細胞病毒感染信號通路、乙型肝炎信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、PI3K/Akt信號通路、EB病毒感染信號通路、膀胱癌信號通路等。其中，中醫(yī)藥可通過調節(jié)PI3K/Akt途徑在肝纖維化發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21]。Lei等[22]發(fā)現(xiàn)，下調PI3K/Akt/mTOR信號通路，可促進細胞外基質的降解，減輕肝實質損害，實現(xiàn)肝纖維化的逆轉。EB病毒也稱為人類皰疹病毒，是一種普遍存在的傳染性病原體，全球每年約有98%的人口被EB病毒感染[23]，而EB病毒是引起肝損傷甚至肝功能衰竭的病原體[24]，可誘發(fā)自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等疾病[25]。肝細胞持續(xù)損傷可導致肝硬化，而肝纖維化是肝硬化必經的中間環(huán)節(jié)。

本研究基于網絡藥理學探討雞血藤抗肝纖維化的作用機制，發(fā)現(xiàn)雞血藤中的多種有效成分可作用于多種靶點和信號通路從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。但是，肝纖維化的病因多種多樣,發(fā)病機制復雜,細胞外基質及肝內各種細胞均參與了肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展,并且受限于各種數(shù)據庫、文獻信息的更新不全，基于網絡藥理學對于雞血藤抗肝纖維化的認識還存在一定的局限性。如何進一步闡明細胞外基質與細胞之間、細胞與細胞之間的相互關系,尤其是中醫(yī)藥在肝纖維化中的作用機制,為肝纖維化治療尋找特異性靶點,可能是今后研究的熱點和難點。