子宮內膜異位癥患者血清微小RNA-92a相對表達水平、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因表達水平與預后的相關性▲

胡林義 張春花 吳 玲 魏善闖 劉 英 方 芳

(江蘇省淮安市婦幼保健院婦科，淮安市 223002，電子郵箱：hulinyi223002@163.com)

子宮內膜異位癥是指有活性的內膜細胞種植在子宮內膜以外的位置而引起的婦科疾病，是中青年婦女的常見病之一，主要臨床癥狀為痛經、月經不調、慢性盆腔疼痛，嚴重者可影響生殖系統功能，造成不孕。子宮內膜異位癥一般為良性病變，但具有惡性腫瘤的生物學特性，如浸潤、轉移、復發等[1]。因此，尋找能特異性地評估子宮內膜異位患者病情發展及預后的相關標志物，具有重要的臨床意義。研究發現，微小RNA(microRNA，miRNA)通過靶向調控mRNA表達，參與機體病理生理的各個過程[2]。有研究顯示，miRNA-92a在卵巢癌中異常表達，參與腫瘤細胞的增殖和凋亡[3]，而子宮內膜異位癥惡變后約有80%進展為卵巢癌[4]。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 gene，PTEN)可參與細胞周期的調控，在卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌等婦科疾病中發揮調節作用[5]。本研究通過檢測子宮內膜異位癥患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平，探討其與患者預后之間的關系，以期為臨床評估子宮內膜異位癥患者的預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年12月于本院婦產科行腹腔鏡手術的200例子宮內膜異位癥患者為研究組，均經術后病理檢查確診，年齡26～43(34.57±5.63)歲。納入標準：(1)月經規律，無內分泌系統、免疫系統疾病；(2)術前3個月內無內分泌類、激素類或抗生素類藥物治療史；(3)非妊娠患者；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他子宮疾??；(2)哺乳期患者；(3)有精神類疾病；(4)合并惡性腫瘤。另選擇同期于我院行腹腔鏡子宮肌瘤切除術的120例患者為對照組，年齡25～41(33.83±4.27)歲。納入標準：(1)均確診為子宮肌瘤；(2)臨床資料完整；(3)符合腹腔鏡手術指征。排除標準：(1)合并其他婦科或內分泌疾病者；(2)妊娠、哺乳或絕經期者；(3)有精神類疾病者。兩組患者的年齡差異無統計學意義(P>0.05)。所有患者均對本研究知情同意，本研究獲得本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集及處理:所有患者于入院后次日清晨抽取空腹靜脈血4 mL，4℃下3 000 r/min離心15 min后取上層清液于干凈EP管，-20℃保存待測。

1.2.2 血清miRNA-92a水平檢測：采用熒光定量聚合酶鏈式反應檢測患者血清miRNA-92a水平。利用TRIzol(Sigma公司，批號：20171205、20181024)提取血清總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以吸光度260/吸光度280值在1.8～2.0之間為純度較好，以純度較好的總RNA進行后續實驗。使用PrimeScript RT反轉錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司，批號：20171228、20181219)將RNA反轉錄為cDNA，嚴格按照說明書操作步驟執行。循環參數：95℃，預變性5 min；90℃，變性15 s；60℃，退火20 s；72℃，延伸30 s；共40個循環。以U6為內參，miRNA-92a上游引物為5′-ACAGGCCGGGGACAAGTGCAATA-3′，下游引物為5′-GCTGTCAACGATACGCTACGCTACGTA-3′；U6上游引物為5′-GGGCTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-GAGCGTGCAGATAATTGACAAGG-3′。利用2-ΔΔCt法計算miRNA-92a的相對表達水平。實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 血清PTEN水平的檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測患者血清PTEN水平，試劑盒購自上海羽朵生物科技有限公司(批號：20180514)，操作步驟按試劑盒說明書執行。

1.2.4 血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素水平的檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測患者血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平，試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司(批號：20180107、20180625、20180316)，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.3 子宮內膜異位癥復發的判定 術后隨訪3個月，觀察子宮內膜異位癥患者的復發情況，分為復發組和未復發組。子宮內膜異位癥復發的診斷標準[6]：(1)術后病灶縮小或消失，臨床癥狀緩解，但3個月后再次出現臨床癥狀，且恢復到治療前水平，甚至加重；(2)再次出現盆腔陽性癥狀，甚至加重；(3)再次出現子宮內膜異位癥病灶。符合其中之一者即判定為子宮內膜異位癥復發。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Pearson法分析復發組患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平與內分泌指標之間的相關性，以及血清miRNA-92a相對表達水平與PTEN水平之間的相關性；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平及二者聯合檢測預測子宮內膜異位癥復發的價值，曲線下面積的比較采用Z檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究組和對照組患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平的比較 研究組患者血清miRNA-92a相對表達水平高于對照組，血清PTEN水平低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 研究組和對照組患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平的比較(x±s)

2.2 子宮內膜異位癥患者血清miRNA-92a相對表達水平與PTEN水平之的相關性分析 子宮內膜異位癥患者血清miRNA-92a的相對表達水平與PTEN水平之間呈負相關(r=-0.455，P<0.001)。

2.3 復發組和未復發組患者血清miRNA-92a的相對表達水平、PTEN水平及內分泌指標水平的比較 術后隨訪3個月，子宮內膜異位癥患者復發64例。復發組患者血清miRNA-92a的相對表達水平及雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未復發組，PTEN水平低于未復發組(均P<0.05)。見表2。

表2 復發組和未復發組患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平及內分泌指標水平的比較(x±s)

2.4 子宮內膜異位癥復發患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平與內分泌指標水平的相關性分析 子宮內膜異位癥復發患者血清miRNA-92a相對表達水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相關(均P<0.05)，PTEN水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈負相關(均P<0.05)，見表3。

表3 復發組患者血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平與內分泌指標水平的相關性分析

2.5 血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平對子宮內膜異位癥復發的預測價值 ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平預測子宮內膜異位癥復發的曲線下面積分別為0.831(95%CI：0.785，0.870；P=0.025)、0.867(95%CI：0.824，0.902；P=0.024)，最佳截斷值分別為1.77、0.80 ng/mL，對應的靈敏度分別為85.00%、91.00%，特異度分別為77.50%、73.33%；二者聯合檢測預測子宮內膜異位癥復發的曲線下面積為0.965(95%CI：0.932，0.987；P=0.007)，靈敏度和特異度分別為92.00%、90.71%。二者聯合檢測預測子宮內膜異位癥復發的曲線下面積高于血清miRNA-92a相對表達水平和血清PTEN水平單獨檢測(Z=4.492，P<0.001；Z=3.121，P=0.002)。見圖1。

圖1 血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平及二者聯合檢測預測子宮內膜異位癥復發的ROC曲線

3 討 論

子宮內膜異位癥的病因和發病機制較為復雜，大多數學者認為在其病灶形成過程中，黏附性血管的形成是其病理生理基礎[7]。miRNA是一類非編碼內源性小RNA分子，通過轉錄后降解mRNA或與3′端非翻譯區結合來抑制翻譯，從而參與調節細胞的增殖、分化、凋亡等過程[8]。研究表明，miRNA-92a在血管生成、器官發育及促進腫瘤細胞的增殖和分化方面發揮重要的調控作用[9]。王利娟等[10]發現，miRNA-92a在宮頸癌細胞中的表達水平升高，其可能通過靶向下調基質金屬蛋白酶2和Survivin蛋白的表達水平，參與腫瘤的發展進程。黃曉艷等[11]的研究證實，miRNA-92a對宮頸癌有一定的診斷價值，推測miRNA-92a可作為宮頸癌篩查和監測的潛在標志物。本研究結果顯示，研究組患者血清miRNA-92a的相對表達水平高于對照組，且復發組患者的血清miRNA-92a的相對表達水平高于未復發組(P<0.05)，提示miRNA-92a在子宮內膜異位癥患者中異常高表達，其高表達可能通過促進黏附性血管增生和病灶形成，參與病情的發生發展過程，對患者預后產生不良影響。

PTEN作為一種重要的信號傳導分子，參與調控細胞周期，在抑制細胞過度增殖、促進細胞凋亡的過程中發揮重要作用[12]，但其抑制細胞增殖的具體機制尚不明了。有學者猜測，抑癌基因PTEN可能是一種促凋亡因子[13]，可誘導機體內正常或異常的細胞凋亡。子宮內膜異位癥常發生于卵巢，具有惡變傾向，可發展為子宮內膜異位癥相關卵巢癌。苗蕓等[14]發現，PTEN在卵巢癌組織中的陽性表達率明顯低于卵巢交界性腫瘤組織，而PTEN陽性患者的總生存時間長于PTEN陰性患者，提示PTEN低表達的卵巢癌患者預后更差。Russo等[15]的研究顯示，PTEN缺失可導致細胞遷移、侵襲作用加強及關鍵調控因子WNT4表達上調，該發現有助于明確卵巢癌早期階段的發病機制，具有重要的臨床意義。本研究結果顯示，研究組患者PTEN水平低于對照組，復發組患者PTEN水平低于未復發組(P<0.05)，與陳華等[16]的研究結果相似。子宮內膜異位癥的發病機制尚不明確，可能是多個因素、多條通路相互影響的結果。趙曦雯等[17]利用生物信息學方法預測PTEN為miRNA-92a的一個下游靶點，miRNA-92a通過與PTEN 3′-非翻譯區結合來靶向負調控PTEN在平滑肌細胞中的表達。本研究結果顯示，子宮內膜異位癥患者血清miRNA-92a相對表達水平與PTEN水平呈負相關(P<0.05)，提示miRNA-92a可能通過靶向負調控PTEN的表達，參與子宮異位癥患者病變細胞的增殖、凋亡過程，高水平的miRNA-92a抑制PTEN蛋白表達，但其具體作用機制有待進一步研究。

既往研究表明，子宮內膜異位癥的發生與雌激素水平密切相關[18]，雌激素分泌紊亂可能誘發細胞周期阻滯，細胞分裂異常，從而導致子宮內膜異常增生，進而發生病變。本研究結果顯示，子宮內膜異位癥復發組患者的血清雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未復發組(均P<0.05)，這可能是由于復發組患者子宮內膜異位病灶重新出現或增多，雌激素不斷累積，導致垂體負反饋調節作用敏感性減弱，從而使血清雌二醇、孕酮、FSH水平升高。Pearson相關分析結果顯示，子宮內膜異位癥復發患者的血清miRNA-92a相對表達水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相關，PTEN水平與雌二醇、孕酮、FSH水平均呈負相關(均P<0.05)，提示血清miRNA-92a、PTEN可能共同參與調控子宮內膜異位癥患者的內分泌代謝，促進病變的發展進程。本研究采用ROC曲線分析進一步探討血清miRNA-92a、PTEN水平對子宮內膜異位癥復發的預測價值，結果顯示，血清miRNA-92a相對表達水平、PTEN水平預測子宮內膜異位癥復發的曲線下面積分別為0.831、0.867，當miRNA-92a>1.77、PTEN<0.80 ng/mL時，子宮內膜異位癥患者術后復發的概率較高，提示血清miRNA-92a相對表達水平和PTEN水平對子宮內膜異位癥術后復發有一定的預測價值；二者聯合預測子宮內膜異位癥復發的曲線下面積為0.965，高于血清miRNA-92a相對表達水平和血清PTEN水平單獨預測時的曲線下面積，提示聯合二者的檢測水平更有利于評估子宮內膜異位癥患者的預后。

綜上所述，子宮內膜異位癥患者血清miRNA-92a呈高表達，PTEN呈低表達，miRNA-92a可能通過靶向負調控PTEN的表達參與患者病情的發展，二者對子宮內膜異位癥復發具有一定預測價值且二者聯合預測的價值更高。