人溶瘤腺病毒的研究進展

申祖杰 王艷杰 康燕燕 林楠 高劍文

摘 要 溶瘤腺病毒是一種經過人工改造的，可以特異性殺傷腫瘤細胞的一類腺病毒。常用的腺病毒為致病力弱的人血清2型或5型腺病毒。該病毒對正常機體的細胞無明顯不良反應，但是可以特異性地在腫瘤細胞中大量增殖、裂解腫瘤細胞和破壞腫瘤微環境。在溶瘤腺病毒的作用下被感染的腫瘤細胞釋放出大量的腫瘤特異性抗原，進而激發全身性的抗腫瘤免疫反應，最終達到治療腫瘤的目的。溶瘤腺病毒治療腫瘤不良反應小、精度高、抗干擾能力強，具有廣闊的運用前景。

關鍵詞 溶瘤腺病毒 腫瘤 免疫療法 聯合用藥

中圖分類號：R979.19 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）21-0076-05

Research progress of human oncolytic adenovirus

SHEN Zujie1， WANG Yanjie2， KANG Yanyan2， LIN Nan2， GAO Jianwen2

（1. Shanghai Sunway Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China； 2. Shanghai Medical Staff University， Shanghai 200135， China）

ABSTRACT Oncolytic adenovirus is a type of human adenovirus that is artificially modified and can specifically kill tumor cells. Commonly used adenovirus is human adenovirus serotype 2 or serotype 5， both are weakly pathogenic adenoviruses. This virus has no obvious adverse reactions to normal body cells， however， it can specifically proliferate in tumor cells in large quantities and lyse tumor cells and destroy the tumor microenvironment. Under the action of oncolytic adenovirus， the infected tumor cells release a large number of tumor-specific antigens， which ultimately stimulate a systemic anti-tumor immune response， and finally achieve the purpose of treating tumors. Oncolytic adenovirus for the treatment of tumors has small adverse reactions， high precision and strong anti-interference abilities and may have broad application prospects.

KEy wORDS oncolytic adenovirus； tumor； immunization therapy； drug combination

惡性腫瘤是目前威脅人類生命健康的重大疾病之一，是繼心血管疾病的世界第二大死因，全球有近1/6的死亡是由癌癥造成的，且近十幾年來惡行腫瘤的發病率每年呈現約3.9%的上升態勢，死亡率每年呈2.5%的上升態勢，防控形勢極其嚴峻[1]。目前針對腫瘤的治療主要包括手術治療、放射治療、化學治療、中醫中藥治療和生物免疫療法等5種，其中生物免疫療法逐漸展現出其治療優勢。溶瘤腺病毒療法屬于生物免疫療法范疇，是通過分子生物學的方法，人為改造腺病毒的基因組結構，使該病毒特異性地感染腫瘤細胞，而不對正常細胞造成威脅的一種新型治療方法[2]。至今世界上已有2種腺病毒類腫瘤藥物上市，分別為復制缺陷型人p53注射液（商品名：今又生），和人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞），其中安柯瑞是世界上首個上市的溶瘤腺病毒藥物[3]。目前世界范圍內有20多種腺病毒相關腫瘤藥物處于臨床試驗階段，且治療及臨床數據結果表明，溶瘤腺病毒治療效果明顯，不良反應小，具有極其優勢的應用前景。本文將著重從腺病毒的生物學特性、作用機制、溶瘤腺病毒類型、新藥研發進展、治療策略以及未來的發展方向及問題等方面加以闡述。

1 腺病毒分類及分子特性

腺病毒是首次從人腺體細胞發現并分離到的無包膜、雙鏈DNA、大小約為70～90 nm的一類病毒。人腺病毒根據其病毒顆粒表面表位的不同分為6個亞屬，57個血清型。不同血清型的腺病毒，致病性及感染部位具有很大的區別，其中基因治療和溶瘤病毒常用的是C亞屬的2型和5型人腺病毒。人腺病毒2型和5型遺傳背景清楚、重組方法成熟，是研究較為詳細的人類腺病毒。腺病毒基因組為線性雙鏈DNA，其兩端各有1個100～600 bp的反向終端重復序列（inverted terminal repeat， ITR），其內側包含腺病毒早期復制相關的E1-E4基因，和晚期表達的結構相關的L1-L5基因[4]。其中E1區和E3區與病毒的復制特性以及免疫逃避功能相關，是常被用來敲除和改造的區域。E1區分為E1A和E1B，E1A主要由289R和243R構成，主要調節細胞的代謝功能而使細胞更易感，E1B 55K基因產物可以與細胞中的p53蛋白相互作用，使其喪失功能，進而阻止p53基因表達產物誘導的宿主細胞分裂停止或細胞凋亡的產生，此外E1B 55K基因產物還與病毒復制、病毒晚期mRNA的轉錄以及病毒RNA的轉運等有關。E3區域基因表達產物的主要功能是破壞免疫防御機制，而與病毒基因組的復制無關，其中gp19K蛋白可以在內質網上與主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex， MHC）I類分子的重鏈結合而阻止其轉運到細胞表面、延緩MHC I的表達，進而破壞被感染細胞的免疫防御機制，而使病毒大量復制，最終裂解細胞[5]。

2 目前常見溶瘤腺病毒的類型

2.1 自然篩選型溶瘤腺病毒

有些病毒具有天然的腫瘤靶向作用，如腺病毒、細小病毒、呼腸孤病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒等，人們通過特異性篩選這些病毒作為治療工具來治療腫瘤[2]。1956年美國國立癌癥研究所開展了對30名宮頸癌患者采用不同血清型的野生腺病毒的腫瘤治療臨床研究，結果顯示，半數以上患者的腫瘤縮小，但該實驗只顯示了局部治療效果，出于對野生篩選型腺病毒的安全性及未知隱患的考慮，該方法當時未被廣泛推廣。直到1996年有研究表明，帶有E1B 55 K基因突變的腺病毒可選擇性地在p53缺陷的腫瘤細胞中復制，從而引起了人們對腺病毒的再次廣泛關注[6]。

2.2 非轉導靶向型溶瘤腺病毒

該方法主要是通過分子生物學的方法，特異性刪除腺病毒的毒性基因如55 kD以及免疫逃避相關基因如gp19K，從而降低腺病毒的毒性，或將其毒性基因替換為免疫監查位點基因如程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1， PD1）、細胞程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1， PDL1）或其他相關基因如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF）、白介素-2（interleukin-2， IL-2）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）等[7]，或者將腺病毒啟動子替換為腫瘤特異性啟動子如TERT等。其中GM-CSF基因較為常用，其表達產物的重要作用是刺激粒細胞、單核巨噬細胞的成熟，并繼發其多種功能。1996年Onyx公司的溶瘤腺病毒dl1520在《科學》雜志發表，同年上海三維生物技術有限公司基于Onyx-015抗癌理論研發出了目前國內唯一上市的溶瘤病毒藥物人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞）。日本Oncolys公司的Telomelysin TM（OBP-301）溶瘤病毒是刪除了E1A區前端的啟動子并替換上了TERT腫瘤特異性啟動子，從而使得該腺病毒可以在腫瘤細胞中特異復制，并對正常細胞無明顯不良反應[8]。溶瘤腺病毒CG0070插入了腫瘤特異性啟動子TERT和GM-CSF基因，從而使得改造后的溶瘤腺病毒可以特異性地在腫瘤細胞內復制，伴隨腫瘤細胞的裂解會釋放出GM-CSF因子和腫瘤特異性抗原，從而刺激人體全身性抗腫瘤免疫反應[9-10]。

2.3 轉導靶向型溶瘤腺病毒

轉導靶向型溶瘤腺病毒相對于非轉導靶向型溶瘤腺病毒，其腫瘤特異性更強，安全性更高，且易于體內清除。其原理是在刪除或替換了腺病毒的某些毒性基因的同時，人為改造并優化了其抗原表位結構域，如fiber蛋白的RGD，從而減少了其感染正常細胞的幾率，降低了治療的不良反應。目前，進入臨床Ⅱ期的DNX-2401溶瘤腺病毒，其原理是在E1A區缺失了24 bp堿基，因此其可以特異性地在RB基因突變的腫瘤細胞內復制，同時對該腺病毒Fiber基因的Hloop區段進行了RGD修飾，從而使得修飾后的溶瘤腺病毒可以與特異性表達整合素αvβ3和αvβ5的腦膠質瘤細胞結合并發揮作用[11]。

3 腺病毒溶瘤作用機制

腺病毒進入機體后，對腫瘤的作用有4個：第一是直接殺傷作用。正常細胞清除病毒的信號通路包括IFN、TLR、JAK-STAT、PKR等[12-13]，當病毒感染正常細胞后，該通路被激活，進而結合免疫反應達到清除病毒的目的。癌細胞相比于正常細胞，其信號傳導及內環境平衡存在異常，當諸如RAS、TP53、RB1和PTEN等基因發生突變后，使得癌細胞更易被病毒感染[14]，因此通過刪除腺病毒與該類蛋白相互作用的非必需基因，如E1區55 kD基因的腺病毒，可以使其選擇性地在腫瘤細胞中大量增殖并裂解腫瘤細胞[9]。第二是介導腫瘤免疫反應。腺病毒可以打破腫瘤的免疫逃避機制，即當腺病毒感染腫瘤細胞后，其在細胞內表達的病毒蛋白，以及干擾細胞的正常代謝而產生的異常蛋白與腫瘤表面的組織相容性復合體Ⅰ類抗原形成復合物，從而改變腫瘤表面抗原特性、介導T淋巴細胞識別并特異性攻擊感染了病毒的腫瘤細胞[15]。第三是腫瘤免疫清除作用。當溶瘤腺病毒感染并殺傷腫瘤細胞及其基質細胞后，會使腫瘤細胞裂解并釋放出大量的腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen， TSA），從而激起全身性的抗腫瘤免疫反應。第四是載體作用。腺病毒在刪除某些毒性基因的同時可以作為載體插入目的基因，在目的基因的表達產物與溶瘤腺病毒的協同作用下，誘導細胞毒性T淋巴細胞、NK細胞等對腫瘤細胞的免疫殺傷作用，增強機體的抗腫瘤免疫反應。

4 已上市及進入臨床的溶瘤病毒藥物

全世界首個溶瘤腺病毒新藥在2005年被批準上市，以鼻咽癌為主要適應證的人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞），該藥為中國原研藥，其治療腫瘤效果明顯、不良反應小、安全性高。目前，中國處于臨床試驗研究的溶瘤腺病毒藥物為成都康弘生物科技有限公司的選擇性溶瘤重組腺病毒注射液KH901，處于臨床Ⅱ期招募階段，其主要適應證為頭頸部腫瘤。國外關于溶瘤腺病毒治療藥物的臨床研究共44個，主要分布于歐洲、美國和加拿大，其中處于臨床Ⅰ期的試驗共25個，處于臨床Ⅱ期的試驗共11個，處于臨床Ⅲ期的試驗1個。具有代表性的是Cell Genesys公司開發的溶瘤腺病毒藥物CG0070，目前該藥物已處于臨床Ⅲ期，主要治療非肌肉性浸潤膀胱癌[16]；DNAtrix公司的溶瘤腺病毒DNX-2401，目前處于臨床Ⅱ期，該藥的主要機理是利用avb3或avb5進入宿主細胞，進而治療腦膠質瘤[11]；ángel Montero Carcaboso設計的溶瘤腺病毒VCN-01，對抗視網膜母細胞瘤，并對眼癌具有良好的治療效果[17]。

5 治療策略

目前，溶瘤腺病毒治療的給藥方式主要為瘤內注射，靜脈注射給藥方式較少，因為靜脈注射往往會引起機體強烈的免疫反應，使得病毒感染腫瘤細胞之前已被免疫系統排除殆盡而達不到溶瘤目的，因此單次或多次瘤內、瘤外精確用藥，使其特異性裂解腫瘤細胞，激發機體抗腫瘤免疫反應，是主要的治療方式[18]。有報道臨床上先通過手術摘除膀胱癌腫瘤，再通過導管將溶瘤腺病毒（CG0070）注射到膀胱，起到了較為理想的治療效果[16]；DNX-2401局部給藥后治療腦膠質瘤的效果明顯[11]。安柯瑞結合經動脈化療栓塞術，通過經腫瘤動脈注射H101的方式，可以有效治療不可切除性的肝細胞癌[19]。因此，摸索不同溶瘤病毒的最佳給藥方式，精確給藥，對溶瘤病毒的治療效果至關重要[20]。

由于溶瘤腺病毒為可復制性腺病毒，因此其抗干擾能力強，可以協同放化療、單抗治療、細胞治療、中藥治療等多種治療方法。如預注射表達IL-7/IL-12的溶瘤病毒，極大增強了PD-1抗體和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4）抗體的治療效果[21]。有報道稱，表達IL-15的溶瘤腺病毒Ad-E2F/IL15與細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte， CTL）治療方法連用，對腫瘤的治療效果明顯大于單獨使用CTL或者Ad-E2F/IL15，具有潛在的臨床應用價值[22]。溶瘤病毒ONCOS-102聯合PD1治療難治性晚期黑色素瘤，觀察到患者血液中促炎性細胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）α、IFN-γ等系統性增加，并引起了強效的全身性抗腫瘤免疫反應[23]。H101聯合化療可以有效治療晚期腫瘤[24]。

使用溶瘤病毒的治療策略多種多樣，使用溶瘤腺病毒治療時，要根據具體腫瘤的類型、腫瘤灶的部位，腫瘤的擴散程度等合理用藥，因此更科學的治療方法仍需要探索，但從初步治療效果可見，其治療效果較為理想。

6 擬解決問題及展望

腺病毒作為溶瘤病毒載體具有極大的潛力，給惡性腫瘤的治療帶來了新的思路與希望，但目前仍有許多問題需要解決，如腫瘤特異性問題。目前上市或在研的產品中，絕大多數為特異性瘤內復制型溶瘤腺病毒，部分正常細胞雖然感染后不利于溶瘤腺病毒的復制，但是會表達毒性因子并引起不良反應，因此尋找廣譜性腫瘤特異性靶點并設計出能夠特異性感染腫瘤細胞的溶瘤腺病毒，是未來研究的一個方向。

目前溶瘤腺病毒給藥方式多為瘤內注射，但機體深處的腫瘤如腦膠質瘤，很難直接瘤內注射，該用藥方式極大限制了溶瘤腺病毒的臨床應用范圍，為了解決該難題，靜脈注射給藥是一個治療思路，但是，由于靜脈注射極易引起強烈的免疫清除反應，被血液稀釋后的病毒很難精確浸潤到腫瘤部位，靜脈高劑量注射溶瘤腺病毒存在潛在安全風險如細胞因子風暴等問題，因此，探索新的給藥方式，新的載體形式，降低機體免疫反應，是溶瘤腺病毒未來急需解決的一個問題。

為了提高對腫瘤的選擇殺傷性，降低不良反應，選擇腫瘤特異性啟動子是一個設計思路，雖然該辦法可以明顯提高溶瘤病毒的特異性，但是由于啟動子的活性普遍較低而使得溶瘤腺病毒在腫瘤細胞中增殖能力較弱，進而大大降低了其溶瘤效果。因此尋找特異性強，活性高的腫瘤特異性啟動子是未來研究的一個方向。

作為溶瘤病毒類產品，同時要考慮生物安全性問題，如改造后的病毒是否穩定，是否與野毒重組而形成新的自然界未有的病毒，攜帶的基因是否可以穩定表達，至今無數據支持。改造的病毒執行功能后，是否可以被機體完全清除，治療過的患者是否會成為傳染源而感染正常人等問題，需要精確的檢測方法和相應的安全性評價體系。有報道稱cidofovir（CDV）可以有效阻止OBP-301溶瘤腺病毒的體內復制，因此尋找抗病毒藥物是提高溶瘤腺病毒安全性的一個設計思路[25]。

雖然腺病毒易于進入細胞，在被感染的細胞內可以充分持續的表達外源基因，且不易整合到宿主基因組，但是腺病毒的基因組大小約為33 kb，外源基因載量小，約為5 kb，因此極大地限制了其溶瘤病毒的應用范圍。

綜上所述，溶瘤腺病毒雖然存在一些問題亟待解決，但其治療效果值得肯定，是一種有前途的腫瘤免疫療法。目前，優化溶瘤腺病毒的構建、降低其臨床的毒性、建立高效遞送體系、建立安全可靠的生物安全評價體系，是急需解決的問題。單一溶瘤腺病毒療法可能較為局限，溶瘤腺病毒療法與其它腫瘤療法的聯合運用，是未來運用的一個方向。隨著人們對腫瘤和病毒的不斷認識，不斷引進新的設計理念，注重生物安全，相信溶瘤病毒具有廣闊的應用前景。

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