22份蒲公英資源酚酸類成分提取及體外功能活性分析

張曉東　孫立亞　孟然　李趙嘉　王秀萍　吳哲

摘要：為了篩選適宜在濱海鹽堿地區域生產的蒲公英優質資源，利用野外搜集、鹽脅迫誘變育種方式獲得22份蒲公英資源。從酚酸類功能成分分析、指紋圖譜質量分析、體外抗氧化試驗以及抑菌能力等角度綜合評價22份蒲公英資源的成分及功能活性。結果表明，誘變蒲公英后代中，T1-3材料的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量分別為13.59、1066、43.08 mg/g，顯著高于親品（品系3）對照材料;本地蒲公英系列中，唐海6、唐海2的咖啡酸含量較高，但綠原酸、總黃酮含量低于T1系列誘變材料。結合質量圖譜分析結果可知，鹽脅迫對蒲公英質量具有提升作用，0.5%鹽脅迫處理能顯著提升誘變系列材料（T4-2、T6-3和T6-4-1）和唐海本地系列（除唐海6外）材料的相應成分含量。抗氧化試驗和抑菌能力測試結果表明，高功能成分含量的蒲公英材料與功能活性測試結果一致，其中T1系列材料的功能活性最強。綜合研究分析可知，T1-1、T1-3、T2-3-2和T3-2-1等誘變材料和唐海2蒲公英資源可作為優質新品系選育材料。

關鍵詞：蒲公英資源;鹽堿地;指紋圖譜;抑菌;抗氧化;酚酸類成分

中圖分類號： S567.23+9.01;R284文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0190-06

蒲公英是菊科蒲公英屬多年生草本植物，其分布廣泛、適應性強，是我國傳統藥食同源植物。蒲公英的活性成分主要是萜類、黃酮類、酚酸類、倍半萜內脂化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌等作用。長期以來，蒲公英主要以粗放式或野生種植為主，關于其人工育種和栽培管理等的研究較少。近年來，隨著蒲公英的醫療與營養保健功能被進一步發掘和利用，蒲公英的需求量呈上升趨勢，人工栽培面積也逐年擴大，迫切需要蒲公英育種和栽培等相關研究。目前，蒲公英育種主要采用資源鑒選、誘變育種等方法，如山西農業大學采用多倍體育種方法育成新品種銘賢1號，河北省農林科學院采用鹽脅迫誘變育種方法育成新品種濱蒲1號，沈陽農業大學采用資源馴化篩選方式育成新品種沈農蒲公英1號等。然而，目前蒲公英新育成的品種依然稀少，難以滿足當前蒲公英醫用、保健、菜用等多樣化需求。基于此，本研究以河北省收集的蒲公英資源以及人工鹽脅迫誘變獲得的共22份蒲公英資源為研究對象，通過不同產地及鹽生環境下的功能成分含量、抗氧化性以及抑菌能力等多個角度分析，綜合篩選表現較好的資源，以期為今后的蒲公英品質育種奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與地點

本研究共包括22份蒲公英材料，其中T系列的12份資源為河北省農林科學院濱海農業研究所以野生的大葉蒲公英葉片為外植體親本，采用鹽脅迫突變體誘變育種方法獲得的表現較好品系材料^[1-3]，其余10份資源是近年來從河北省各地收集的且在本地表現較好的材料，暫以收集地點命名，詳見表1，其中誘變后代材料的親本（品系3）及市售栽培品種（保定）為對照。所有試驗均在濱海農業研究所現代農業示范基地進行，試驗時間為2020年8—9月。

1.2試驗方法

1.2.1蒲公英栽培及取樣所有蒲公英資源種子均在溫室中播種（2020年8月17日），待長出3張葉片時移栽至示范基地大田中，栽培行距×株距為20 cm×10 cm，試驗期內采取負壓滴灌自動灌溉系統，其中負壓控制的土壤基質勢為-15 kPa，水資源為灤河河水^[4-5]。田間土壤為濱海鹽堿土，土壤含鹽量為0.3%～0.4%，土壤容重為1.4～1.6 g/cm3，地下水埋深為0.8～1.2 m，地下水礦化度>10 g/L，土壤pH值為7.8～8.5，有機質含量為1.426%，速效氮含量為62.3 mg/kg，速效磷含量為27.1 mg/kg，速效鉀含量為232 mg/kg。

隨機選擇其中的10份資源另行設定鹽脅迫處理，鹽脅迫濃度為0.5%，采用地下微咸水（原始鹽度為1.2%）調配，對照處理的鹽濃度為0.1%，鹽脅迫試驗在示范基地的耐鹽鑒定池中進行[5-6]。待蒲公英移栽1周后（2020年9月14日）進行第1次飽和灌溉微咸水，移栽2周后（2020年9月21日）重復1次，移栽3周后（2020年9月28日）對所有處理采樣并進行成分檢測和功能測試。

1.2.2蒲公英成分的提取參照《中華人民共和國藥典》（2020版），將蒲公英鮮葉放置于烘箱中，于60 ℃烘干至水分含量低于13%，然后將蒲公英粉碎過80目篩，稱取約0.1 g樣品，加入5 mL纖維素酶溶液（質量濃度為0.1%，pH值為4，酶活性為 5 000 U/g）;于60 ℃水浴30 min后用70%甲醇溶液定容至25 mL，然后超聲處理120 min，超聲功率為120 W;隨后于4 000 r/min離心15 min，取上清液，備用^[7-8]。

1.2.31，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試驗? 按照“1.2.2”節中所述方法，分別取1 mL提取液置于10 mL離心管中，加入3 mL 0004% DPPH溶液，室溫下避光反應30 min，以無水乙醇作為空白對照，在517 nm波長處測定吸光度。按下式計算DPPH自由基清除率^[9]：

式中：D₀為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;D_s為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;D_c為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無水乙醇的吸光度。

1.2.4抑菌能力測試按照“1.2.2”節所述方法，將提取液旋轉蒸干濃縮至生料濃度為2.5 g/mL，備用。將活化后的金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌分別接種到營養肉湯培養基上，于32 ℃培養24 h后，用比濁法將各菌株用無菌水配制成106 CFU/mL的菌懸液。采用預混勻法向牛肉膏蛋白胨平板中加入0.2 mL細菌的菌懸液，采用濾紙片法進行體外抑菌能力測試，以5 μg/mL芐卡青霉素鈉為陽性對照。處理24 h后測量抑菌圈直徑，重復3次，計算平均抑菌圈直徑^[10]。

1.3咖啡酸、綠原酸及總黃酮含量的檢測

按照“1.2.2”節中所得提取液，用注射器和045 μm有機濾膜將濾液注入進樣瓶中，再用高效液相色譜法（HPLC）檢測咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量。其中HPLC條件為安捷倫1200 HPLC，鉆石1代C18色譜柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動相A（0.02% 磷酸水溶液） ∶流動相B（甲醇）=50 ∶50;檢測波長為350 nm;柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min;進樣量為10 μL。

配制不同濃度的綠原酸、咖啡酸和蕓香苷標品，與對應的HPLC峰面積建立標準曲線，經擬合后，標準曲線分別如下：y₁=16.835x₁-16.971，r²=0.999 6;y₂=22.173x₂-13.042，r²=0.999 2;y₃=15.467x₃+1.900，r²=0.999 6。式中，y₁、y₂、y₃分別為綠原酸、咖啡酸、蕓香苷的峰面積;x₁、x₂、x₃分別為綠原酸、咖啡酸、以蕓香苷計的總黃酮含量，有效檢測范圍均為0～100 μg/mL^[7-9]。

1.4數據處理

所有數據處理均設3次重復，所得數據均使用Excel 2010進行統計，并采用SPSS 22.0軟件分析，包括單因素方差分析和Duncans（D）顯著性分析。蒲公英成分質量采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）進行分析，數據形式為平均值±標準差。

2結果與分析

2.1蒲公英資源和品系的功能成分含量分析

對22個蒲公英品系的綠原酸、咖啡酸和總黃酮含量進行測定后，按照材料編號排列，其中標記為T的材料為鹽脅迫誘變后代，品系3為誘變材料的親本，詳見表1。T1系列材料和T3-2-1 3類功能成分的總體水平較高，T1-3材料的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量均最高，分別較親本提高了1.43、2.96、2.61倍，分別比市場銷售品種（保定）提升了1.24、2.29、2.21倍;T3-2-1材料的3類功能成分較高，分別較親本提升了0.90、2.40、1.90倍，分別較市場銷售品種（保定）提升了0.76、1.82、158倍。在唐海本地系列蒲公英中，唐海6、唐海2的表現較好，咖啡酸含量較高，但綠原酸、總黃酮含量低于上述誘變系列。綜合品質分析認為，T1-1、T1-3、T1-4、T3-2-1等誘變材料和唐海2、唐海6為代表的本地蒲公英資源可作為優質候選新品系。

另外，由于本試驗所處地區為濱海鹽堿地區域，考慮到田間的實際情況，特別考察了鹽脅迫對蒲公英功能成分的影響。從表1中隨機選出10份材料，測試它們在0.5%鹽脅迫下的功能成分含量，結果見圖1。由圖1可以看出，鹽脅迫明顯提升了大部分蒲公英資源的功能成分含量，其中誘變系列資源（T4-2、T6-3和T6-4-1）在鹽脅迫下的咖啡酸、綠原酸、總黃酮含量較對照提升了4.4%～33.3%，然而這些物質的含量整體較唐海本地系列及親本低。在唐海系列蒲公英中，除了唐海6外，其余唐海本地系列蒲公英在鹽脅迫下的功能成分含量呈降低趨勢。邯鄲蒲公英的咖啡酸、綠原酸、總黃酮含量在鹽脅迫下均最高，且分別較對照提升了1.79、0.72、1.37倍。從濱海鹽堿地區域蒲公英栽培的角度考慮，鹽脅迫下功能成分含量較高的資源可作為優質蒲公英候選品系。

2.2蒲公英品系的體外抗氧化功能驗證

以22份蒲公英資源的酚酸提取物為材料，對DPPH自由基消除能力進行驗證。由圖2可以看出，突變體材料中除了T3-2-2、T5-3-1和T6系列外，其余材料對DPPH自由基的清除率均在82.8%以上，與親本品系3、唐海本地系列相當，其中T1系列的表現優于T2系列，T1-4對DPPH自由基的清除率最高，為94.9%，與親本相比提高了7.0%，與市場銷售品種（保定）相比提高了38.6%，說明該誘變體系總體上具有較強的抗氧化活性。

2.3蒲公英品系的抑菌功能驗證

以卞卡青霉素鈉的抑菌能力作為陽性對照，計算22個蒲公英材料與對照之間的抑菌能力差異。由圖3可以看出， 蒲公英提取液對2種細菌都表現

出一定的抑菌能力，但材料之間抑菌能力的強弱不同，與對照相比，突變體材料T1-1、T2-3-2、T2-3-4、T3-2-1、T6-4-2對2種細菌較其余材料均表現出較強的抑菌能力，對金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌能力分別較對照高2.1%～5.9%、

1.3%～9.0%。非誘變材料中，唐海2和品系3也

表現出較強的抑菌活性。其余非誘變材料盡管也表現出一定的抑菌活性，但是與對照相比，抑制這2種細菌能力分別降低了0.7%～32.6%、1.7%～36.6%。上述結果表明，相對而言突變體材料具有較高的抑菌活性。

2.4蒲公英指紋圖譜質量分析

將表1中的22份蒲公英材料以及部分作耐鹽處理的材料（共計37個）的HPLC記錄峰譜導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”軟件，經過峰點校正和數據匹配，以親本品系3為參照圖譜，以中位數法t=0.1 min建立對照指紋圖譜（圖4）。根據峰匹配結果，以峰面積為參數，計算出待試蒲公英指紋圖譜與對照圖譜的整體相似度，結果表明，所有待試材料的相似度均大于0.9，符合指紋圖譜相似度要求。圖4中的S1～S12為突變體誘變系列，其中與親本（S13）相似度相當的有T6-4-1、T6-4-2、T6-3 和T2-3-2，其中T6-4-1相似度最高，為0.997;S14～S17為除唐海本地外河北省收集的蒲公英材料，其中保定蒲公英（S15）的相似度最高，為0.997;S18～S27、S28～S37為10個蒲公英材料（見表1中額外標記的編號）在非鹽脅迫和0.5%鹽脅迫下的圖譜，可以看出，在鹽脅迫下各蒲公英圖譜的峰面積均變大，而對應的相似度也有所提升，從 0.990～0998提升至0.995～0.999，說明鹽脅迫能夠增加蒲公英主要成分含量，進而提升蒲公英的質量。由圖5可以看出，這批蒲公英材料中典型的共有峰有4個，分別對應七葉內酯^[11]、綠原酸、木樨草苷和咖啡酸。

3結論與討論

蒲公英含有多種活性成分，如黃酮類、皂苷類、酚酸類和多糖等[12]，其中含酚酸類物質種類較多。酚酸類物質包括咖啡酸和綠原酸，具有明顯的抑菌作用。此外，蒲公英中還含有較高含量的菊苣酸、單咖啡酰酒石酸，這2種有機酸均為咖啡酸的衍生物，具有降糖、降脂、抗菌、抗病毒和治療感冒的功效[12-13]。本試驗發現，部分誘變獲得的蒲公英材料中的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量較親本顯著提升，這些材料包括T1-1、T1-3、T1-4、T2-3-2及T3-2-1，唐海本地系列中的唐海2、唐海3、唐

海5、唐海6的功能成分也顯著高于誘變親本，另外鹽脅迫處理也有利于蒲公英材料功能成分的累積。從抗氧化性試驗和抑菌能力測試結果看出，這些材料均較其余材料表現出較好的功能性，尤其是T1系列材料，與其余蒲公英材料相比其功能活性最強。該結果表明，高功效成分的材料具有較高的功能活性。該結論與目前多數藥用植物功效研究結論一致，例如孫博等利用超高效液相色譜儀連接二級陣列檢測器（UPLC-DAD）檢測方法對不同產地13批次蒲公英制成的飲片主成分檢測，結果表明，高咖啡酸含量（11.34 μg/mL）的蒲公英質量最高^[14]。孫長霞等研究了不同溶劑提取的蒲公英提取物的體外抑菌效果，結果表明，蒲公英醇提液得率及抑菌能力（枯草芽孢桿菌、金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25～0.75 g/mL）均高于水提液^[15]。然而，植物中的功能活性物質并非單一成分，對提取物中的具體成分功效還應繼續研究。

本研究發現，不同處理能夠影響蒲公英化學成分的含量，其中部分的誘變系列如T4-2、T6-3和T6-4-1的主要功能成分含量比親本或其他資源低，其功能活性及指紋圖譜質量評價結果也均低于其他資源，原因可能在于鹽脅迫誘變過程中某基因缺失造成的連鎖反應。劉艷芬等利用NaCl脅迫蒲公英愈傷組織，經隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）分子鑒定結果表明，與親本愈傷組織相比，在0.8%、1.0%鹽度下，750、500 bp處分別少了1、2條帶，推測缺失的該基因可能與蒲公英功能成分合成有關^[2-3]。另外鹽脅迫也會影響蒲公英功能成分含量。本研究發現，除了唐海2、唐海3和唐海5資源外，其余所有蒲公英在鹽脅迫下的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量均有提升，該結論與目前一些研究結果一致。例如Wu等研究鹽堿地蒲公英栽培技術對蒲公英生長和功能成分的影響發現，在0.3%～04%土壤鹽度條件下，蒲公英中綠原酸、總黃酮含量最高，同時也發現，蒲公英耐鹽的閾值為0.40%～043%，過高的鹽脅迫會影響蒲公英功能成分的積累^[16]。在本研究中，唐海2、唐海3和唐海5蒲公英資源在0.5%鹽脅迫條件下的功能成分下降，可能與該系列蒲公英的耐鹽閾值較低有關，需要進一步驗證。

目前關于蒲公英功能成分方面的評價研究較多，然而缺乏相關的標準。2015 版《中華人民共和國藥典》規定了合格的蒲公英標準為咖啡酸含量不低于0.02%;2020版《中華人民共和國藥典》則規定了合格的蒲公英標準為菊苣酸含量不低于045%，蒲公英飲片中的菊苣酸含量不低于0.3%。然而，無論《中華人民共和國藥典》如何規定，現代中醫藥學認為，中藥是一個多組分的化學庫，它的療效不是來自單一的活性化學成分，而是來自多種成分之間的協同作用^[17]。中藥質量指紋圖譜分析則得益于多成分批量模糊分析而廣泛用于中藥化學成分質量評價、品種篩選、產品篩選等。如孫博等以綠原酸為特征利用指紋圖譜分析篩選了綜合質量較好的蒲公英飲片^[14];李景華等則以咖啡酸為特征利用指紋圖譜對吉林市12種蒲公英質量進行了分析^[17];馮倩等則以咖啡酸和總黃酮為特征分析了不同產地蒲公英藥材質量^[18]。本研究則通過咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量結合指紋圖譜對22份蒲公英資源共計37個處理進行了分析和驗證，結果表明，蒲公英資源的功能成分與指紋圖譜質量分析結果一致，可充分說明這些資源可作為高質量蒲公英品種的候選資源，例如部分的T1系列、T2系列及唐海系列。蒲公英育種不僅僅依據功能成分，也與蒲公英的生物量、抗病性等密切相關，由此可見，篩選或培育一個優秀的蒲公英品種需要綜合考慮各因素指標。

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基金項目：河北省農業科技創新工程（編號：2019-1-6-1）;河北省省級科技計劃（編號：19227126D）;唐山市重點研發計劃（編號：19150202E）。

作者簡介：張曉東（1965—），男，河北石家莊人，副研究員，主要從事功能產品研發及鹽堿地高效利用研究。E-mail：nkybhszxd@163.com。

通信作者：吳? 哲，博士，副研究員，主要從事功能植物成分提取及產品開發研究。E-mail：wuzhe26l@163.com。