內含子源性長鏈非編碼RNA SOS1?IT1對肝癌細胞的調控

付楠楠 劉蕊 劉濤

1天津市兒童醫院（天津大學兒童醫院）消化科（天津300134）：2天津市第一中心醫院國家衛生健康委員會危重病急救醫學重點實驗室（天津300192）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）位居全球惡性腫瘤發病率第5 位，死因第3 位。我國每年約34.4 萬人死于肝癌，占世界肝癌死亡病例的55%。肝癌常在確診時已屬晚期，且由于其轉移率及術后復發率較高，預后較差。我國有1.2 億乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者，HBV 的慢性感染容易促使肝細胞發生惡性轉變［1］，這是我國人群肝癌高發的重要原因之一。肝癌嚴重威脅我國人民健康，而且為患者帶來沉重的經濟負擔［2］。

肝癌的發生發展是由于一系列癌基因和抑癌基因的突變積累，或者受表觀遺傳等因素的調控導致癌基因異常高表達和抑癌基因異常低表達所導致的［3］。因此，闡明肝癌發生發展的具體機制，是認識肝癌發生機理的必要過程，也是在分子水平上尋找肝癌早期診斷和治療方法的關鍵環節。

長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，ln?cRNA）是一類長度大于200 nt 的不具備蛋白編碼能力的RNA，廣泛參與基因表達調控，與惡性腫瘤的發生和發展密切相關［4-6］。在前期研究中，筆者發現SOS1?IT1 是一條來源于基因內含子序列的lncRNA，其可能與肝癌的發生發展相關。本研究通過體外實驗證實SOS1?IT1 對肝癌細胞惡性表型的促進作用，并探究其作為內含子來源的lncRNA對宿主基因可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑人肝癌細胞系QGY?7703購自中國科學院細胞庫，在含10%胎牛血清（法國Biowest 公司）的RPMI?1640 培養基（北京索萊寶公司）中，置于37 ℃、含5%CO2的恒溫培養箱中進行傳代培養。pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1（+）/EGFP 和pSilencer 2.1 U6 neo 質粒由本實驗室保存。Lipo?fectamine 2000 轉染試劑購自美國ThermoFisher 公司，CCK?8 試劑購自上海東仁（Dojindo）公司，EdU細胞染色試劑盒購自廣州銳博公司，分子生物學工具酶（核酸內切酶、連接酶等）購自北京寶日醫（TaKaRa）公司，AxyPrep 質粒純化試劑盒購自美國Corning 公司。DNA 合成由北京奧科鼎盛公司完成，miRNA mimics 合成由上海吉瑪公司完成。

1.2 生物信息學miR?124 成熟體序列由miRBase數據庫（http：//www.mirbase.org/）獲取。 lncRNA SOS1?IT1全長序列由Ensembl數據庫（http：//asia.en?sembl.org/index.html）獲取。miR?124 和SOS1 mRNA的潛在靶定關系通過TargetScanHuman 7.2 數據庫（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預測。miR?124和lncRNA SOS1?IT1 的潛在靶定關系通過ENCORI數據庫（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預測。

1.3 質粒載體構建

1.3.1 SOS1?IT1 全長及SOS1?IT1?MRE 過表達質粒構建將全長1 191 bp 的SOS1?IT1 全長序列合成后，克隆插入pcDNA3.1（+）質粒的EcoRI?XhoI 位點中，構建SOS1?IT1 全長過表達質粒。將SOS1?IT1?MRE 野生型（wild type，wt）序列或突變型（mu?tant，mut）序列（表1）合成后，克隆插入pcDNA3.1（+）質粒的BamHI?EcoRI 位點中，構建SOS1?IT1?MRE 過表達質粒。

表1 SOS1?IT1 和SOS1 mRNA 所包含的miR?124 潛在結合位點序列Tab.1 Sequence of the potential miR?124 response elements within SOS1 mRNA and SOS1?IT1

1.3.2 SOS1?IT1短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達質粒構建將SOS1?IT1 的shRNA 序列（5′?GCACTAACCTCGAAGTTAG?3′）導入發夾結構的骨架序列中，合成DNA 并克隆插入pSilencer 2.1 U6 neo 質粒的BamHI?HindIII 位點中，構建shR?SOS1?IT1 表達質粒。

1.3.3 熒光報告基因質粒構建將預測的SOS1?IT1 或SOS1 mRNA 所包含MRE 的野生型或突變型序列（表1）克隆插入pcDNA3.1（+）/EGFP 質粒中位于EGFP 編碼區下游的BamHI?EcoRI 位點中，構建熒光報告基因質粒（圖1、2）。

圖1 SOS1?IT1?MRE 熒光報告基因質粒結構圖示Fig.1 Graphic presentation of the SOS1?IT1?MRE fluorescent reporter gene plasmids

圖2 SOS1?MRE 熒光報告基因質粒結構圖示Fig.2 Graphic presentation of the SOS1?MRE fluorescent reporter gene plasmids

1.3.4 miR?124 過表達質粒構建將人基因組中包含miR?124 前體的一段190 bp 的序列擴增并克隆插入pcDNA3.1（+）質粒中，并轉染細胞，提高細胞內miR?124 的水平［7］。

1.3.5 miR?124 抑制物表達質粒構建構建miR?124 的“強誘餌”（tough decoy，TuD）RNA 表達質粒，并轉染細胞，抑制細胞內miR?124 的活性［7］。以上所有質粒均經過測序驗證，擴增并純化后用于細胞轉染。

1.4 CCK?8 細胞活性檢測轉染后的QGY?7703細胞按照5 × 103/孔的密度接種96 孔板，每組設立3 個復孔。次日在各孔細胞中加入CCK?8 試劑10 μL，繼續培養2 h 后，測定各孔細胞在450 nm 處的吸光度值A450，用以評估細胞活性。

1.5 EdU 細胞DNA 復制活性檢測轉染后的QGY?7703 細胞按照5 × 103/孔的密度接種96 孔板，每組設立3 個復孔。次日，用含50 μmol/L EdU試劑的培養基培養細胞2 h，而后4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X?100 通透處理細胞。加入Apollo染色液，對EdU 進行特異性染色，并用Hoechst 染液標記細胞核。在熒光顯微鏡下觀察EdU 染色情況并拍照，應用ImageJ 軟件分析各組細胞的熒光強度，用綠色熒光（EdU）/藍色熒光（Hoechst）的比值，即單位數量細胞的EdU 熒光強度來評估細胞的DNA 復制活性。

1.6 熒光報告基因實驗按照實驗分組，將熒光報告基因質粒載體和其他質粒或寡核苷酸共轉染QGY?7703 細胞。次日用RIPA 裂解液裂解細胞提取蛋白，微孔板讀數儀檢測單位數量細胞內綠色熒光蛋白EGFP 的熒光強度（激發光488 nm，發射光509 nm），評估miRNA 對特定MRE 的作用強度。

1.7 統計學方法應用GraphPad Prism 7 軟件進行數據分析。多組間差異比較應用單因素方差分析，組間的進一步兩兩比較應用Student?Newman?Keulsq檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞活性的影響在QGY?7703 細胞中，過表達SOS1?IT1 后細胞活性增強（P< 0.05），抑制SOS1?IT1 后細胞活性降低（P<0.05，表2）。

表2 CCK?8 實驗檢測SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞活性的影響Tab.2 Effect of SOS?IT1 on QGY?7703 cell viability by CCK?8 test ±s

表2 CCK?8 實驗檢測SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞活性的影響Tab.2 Effect of SOS?IT1 on QGY?7703 cell viability by CCK?8 test ±s

注：與pcDNA3 組相比，*P<0.05；與shR?NC 組相比，**P<0.05

組別pcDNA3 pcDNA3/SOS1?IT1 shR?NC shR?SOS1?IT1 F 值P 值A450值0.928±0.104 1.184±0.114*0.870±0.091 0.648±0.062**16.23 0.001

2.2 SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞DNA 復制活性的影響在QGY?7703 細胞中，過表達SOS1?IT1 后細胞DNA 復制活性增強，表現為綠色熒光的相對強度增加（P< 0.05）。抑制SOS1?IT1 后細胞DNA復制活性降低（P<0.05，圖3、表3）。

表3 EdU 實驗檢測SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞DNA 復制活性的影響Tab.3 Effect of SOS1?IT1 on QGY?7703 DNA replication activity by EdU test ±s

表3 EdU 實驗檢測SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞DNA 復制活性的影響Tab.3 Effect of SOS1?IT1 on QGY?7703 DNA replication activity by EdU test ±s

注：與pcDNA3 組相比，*P<0.05；與shR?NC 組相比，**P<0.05

組別pcDNA3 pcDNA3/SOS1?IT1 shR?NC shR?SOS1?IT1 F 值P 值EdU/Hoechst 熒光強度比值0.206±0.016 0.625±0.013*0.271±0.033 0.126±0.022**192<0.001

圖3 EdU 實驗檢測SOS1?IT1 對QGY?7703 細胞DNA 復制活性的影響（200×）Fig.3 Effect of SOS1?IT1 on QGY?7703 DNA replication activity by EdU test（200×）

2.3 miR?124 直接靶定SOS1 mRNA 和SOS1?IT1并調控其表達生物信息學預測發現，SOS1 mRNA的3′非翻譯區（3′ untranslated region，3′UTR）包含3 個miR?124 的潛在結合位點，SOS1?IT1 包含1 個miR?124 的潛在結合位點（表1）。

將3 個SOS1?MRE 均為野生型序列的熒光報告基因質粒轉染細胞后，綠色熒光強度隨miR?124的水平呈反向變化（P<0.05）。將這3 個結合位點全部突變后，綠色熒光強度不再隨miR?124 的水平變化而改變（P> 0.05，表4）。進一步將這3 個結合位點中的任意2 個進行突變，發現將第2 和第3 個位點突變，或將第1 和第3 個位點突變后，熒光強度仍隨miR?124 的水平呈反向變化（P< 0.05）。而將第1 和第2 個位點突變后，熒光強度不再隨miR?124 的變化發生改變（P>0.05，表4）。提示第1 和第2 個結合位點能夠有效結合miR?124，而第3 個結合位點不能與miR?124 發生有效結合。

表4 EGFP 報告基因實驗驗證miR?124 對SOS1 mRNA 的直接調控Tab.4 Direct regulation of miR?124 on SOS1 mRNA verified by EGFP fluorescent reporter assay ±s，×104

表4 EGFP 報告基因實驗驗證miR?124 對SOS1 mRNA 的直接調控Tab.4 Direct regulation of miR?124 on SOS1 mRNA verified by EGFP fluorescent reporter assay ±s，×104

注：與pcDNA3 組相比，*P<0.05；與pSIH1 組相比，**P<0.05；與pcDNA3 組相比，#P>0.05；與pSIH1 組相比，##P>0.05

組別pcDNA3 pri?124 pSIH1 TuD?124 F 值P 值EGFP/SOS1?MREwt 3.29±0.232 1.53±0.259*3.07±0.107 4.21±0.334**60.62<0.001 EGFP/SOS1?MRE1/2/3mut 3.85±0.264 3.59±0.098#3.91±0.131 3.93±0.306##1.615 0.261 EGFP/SOS1?MRE2/3mut 3.61±0.288 2.66±0.377*3.54±0.041 5.45±0.433**39.60<0.001 EGFP/SOS1?MRE1/3mut 3.94±0.157 2.45±0.181*3.95±0.298 5.60±0.358**72.34<0.001 EGFP/SOS1?MRE1/2mut 3.73±0.468 3.58±0.394#4.23±0.271 4.36±0.319##3.108<0.001

類似地，將包含SOS1?IT1?MRE 的熒光報告基因質粒轉染QGY?7703 細胞，發現該位點為野生型的熒光報告基因質粒所表達的綠色熒光強度隨miR?124 呈反向變化（P< 0.05），而突變型載體熒光強度不隨miR?124 的變化而改變（P> 0.05，表5）。表明該位點為miR?124 的有效結合位點。

表5 EGFP 報告基因實驗檢測miR?124 對SOS1?IT1 的直接調控Tab.5 Direct regulation of miR?124 on SOS1?IT1 verified by EGFP fluorescent reporter assay x±s，×104

2.4 SOS1?IT1?MRE通過結合miR?124調控SOS1 mRNA 的表達將含有SOS1?MRE 野生型序列的熒光報告基因質粒轉染QGY?7703 細胞，同時過表達SOS1?IT1?MRE 的野生型序列，發現綠色熒光強度較對照組增加（P<0.05）。進一步抑制細胞內的miR?124 后，熒光強度明顯回落（P< 0.05）。若將SOS1?IT1?MRE改為突變型序列，綠色熒光強度與對照組相比無明顯變化（P>0.05，表6）。

將含有SOS1?MRE 突變型序列的熒光報告基因質粒轉染QGY?7703 細胞，同時過表達SOS1?IT1?MRE 的野生型序列后，熒光強度不再發生改變。進一步抑制miR?124 后，熒光強度亦無變化（P>0.05，表6）。

表6 EGFP 報告基因實驗檢測SOS1?IT1?MRE 對SOS1 mRNA 表達的調控Tab.6 Regulation of SOS1?IT1?MRE on SOS1 mRNA verified by EGFP fluorescent reporter assay ±s，×104

表6 EGFP 報告基因實驗檢測SOS1?IT1?MRE 對SOS1 mRNA 表達的調控Tab.6 Regulation of SOS1?IT1?MRE on SOS1 mRNA verified by EGFP fluorescent reporter assay ±s，×104

注：與第1 組相比，*P<0.05；與第3 組相比，**P<0.05；與第1 組相比，§P>0.05；與第1 組相比，#P>0.05；與第3 組相比，##P>0.05

編號1 2 3 4 5組別pcDNA3 SOS1?IT1?MREwt SOS1?IT1?MREwt+pcDNA3 SOS1?IT1?MREwt+pri?124 SOS1?IT1?MREmut F 值P 值EGFP/SOS1?MREwt 2.71±0.180 3.68±0.315*4.04±0.079 1.09±0.143**2.57±0.244§90.92<0.001 EGFP/SOS1?MRE1/2/3mut 2.88±0.169 2.66±0.200#2.80±0.170 2.66±0.183##?1.062 0.417

3 討論

對肝癌發生發展分子機制的探究，有助于開發針對肝癌早期診斷的分子標志物，以及有效的治療藥物靶點。本研究主要探究lncRNA 對肝癌發生發展的調控機制。

真核生物基因組中蘊含著大量的非編碼序列。在人類基因組中，有超過70%的序列能夠被轉錄生成RNA，但僅2%左右的序列能夠編碼蛋白［8］。這些無編碼蛋白能力的RNA稱為非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）。ncRNA 具有很多的種類，其中lncRNA 是一類廣泛參與基因表達調控、功能較為活躍的ncRNA。lncRNA 的長度可從200 bp 到100 kb，且缺乏編碼蛋白的能力。lncRNA 并非先前被認為的那樣是“轉錄噪音”（transcription noise），而是具有活躍的調控功能，參與細胞的多種生理過程，包括對染色質的調控、轉錄水平和轉錄后水平的基因表達調控、蛋白功能調控、充當特定大分子的“吸附物”等［9］。目前已證實，lncRNA 與肝癌發生發展之間存在密切的關系［10］。本研究通過體外實驗發現，長度為1 191 bp 的lncRNA SOS1?IT1 在肝癌細胞中發揮癌基因的功能，能夠增強肝癌細胞的活性。基因組DNA 的復制是細胞增殖過程中發生的重要過程，SOS1?IT1 能夠加速這一過程，這可能是其促癌活性的主要機制之一。

闡明lncRNA 發揮作用的分子機制是其功能研究的重要環節。lncRNA 具有多種作用模式，能夠和DNA、RNA 和蛋白發生廣泛的相互作用，其作用過程發生在表觀遺傳學層面、轉錄水平、轉錄后水平等多個層次［11］。有一類lncRNA 來源于編碼基因的內含子（intron），被稱為內含子源性lncRNA（intronic lncRNA）［12］，其命名方式為在編碼基因名稱后加?IT 后綴，IT 即intron 一詞的縮寫。遺傳學研究已證實，真核生物的結構基因為斷裂基因（split gene），即編碼蛋白的基因序列在基因組DNA中被一些無編碼作用的堿基序列分隔開。在轉錄過程中，首先生成不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），繼而經過剪接加工過程，去除不編碼蛋白的序列即內含子，將編碼序列（外顯子，exon）部分拼接起來，該過程是mRNA 加工成熟的重要環節。既往認為，內含子是mRNA 加工成熟過程中的“廢棄物”或“副產物”。但近年來多項研究表明，剪切下來的內含子RNA 能夠影響轉錄起始效率、轉錄產物輸出細胞核、增強轉錄產物穩定性等，從而在轉錄后水平上協助宿主基因的表達［13-14］，這些研究否定了先前認為內含子RNA 僅為mRNA 加工成熟過程中“廢棄物”的觀點。隨著研究的深入，發現有些內含子能夠發揮與lncRNA 類似的活性，這也為內含子的功能拓展提供了新的方向。本研究所涉及的SOS1?IT1 即為一種來源于真核生物內含子的lncRNA 分子，其位于人類SOS1 基因的內含子19 和20 之間，與宿主基因SOS1 一同轉錄，并隨著SOS1 mRNA 的加工成熟過程而生成。探究其在肝癌細胞中發揮癌基因活性的分子機制，是后續研究的重點。

lncRNA 與生物大分子之間存在廣泛的相互作用，其與microRNA（miRNA，miR）的相互作用形成了競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制。miRNA 是另一類內源性的ncRNA家族，其成熟體的長度很短，長度約22 nt，經典作用模式是通過與靶RNA（可能是具有編碼能力的mRNA 或ncRNA）的3′ UTR 發生不完全互補配對結合，來抑制靶RNA 的翻譯或促使其降解，且miRNA 與腫瘤發生發展亦有密切的關系［15］。與正常肝細胞相比，肝癌細胞中的miRNA 表達譜發生明顯改變，且參與肝癌的發生發展過程［16］。當不同的兩條或幾條RNA 分子序列上具有相同的miRNA 結合位點（即miRNA 反應元件，miRNA re?action element，MRE）時，這些RNA 分子能夠通過競爭性結合細胞內有限的miRNA 來影響各自的表達水平，這種調控模式即為ceRNA［17］。ceRNA 調控模式是細胞內不同RNA（包括編碼蛋白的mRNA 和非編碼RNA）相互交流（crosstalk）的重要模式之一，ceRNA 調控網絡的異常也與肝癌等多種惡性腫瘤的發生密切相關［18］。本研究初步證實，SOS1?IT1 與其宿主基因SOS1 的mRNA 均含有miR?124的結合位點，SOS1?IT1 通過與SOS1 mRNA 競爭性結合miR?124 來減輕miR?124 對SOS1 表達的抑制，從而正向調控SOS1 的表達，這一結論由以下實驗證據支持。一方面，SOS1 mRNA 的3′UTR 含有3 個潛在的miR?124 結合位點（MRE），且通過實驗證實前2 個位點為功能性的結合位點。SOS1?IT1 亦含有1 個能被驗證的miR?124 的功能性結合位點。這表明SOS1?IT1 及其宿主基因的mRNA 含有相同的MRE，這為二者的ceRNA 調控提供了可能。另一方面，在肝癌細胞系中過表達SOS1?IT1 上的MRE 序列，能夠導致SOS1?MRE 上游的熒光報告基因表達增強。這表明SOS1?IT1?MRE 能夠競爭性地吸附更多的內源性miR?124，從而減輕SOS1基因被抑制的程度。進一步在細胞中過表達miR?124，已增強的熒光強度重新回落，表明過量的miR?124 超出了SOS1?IT1?MRE 的結合能力，SOS1基因的表達重新受到抑制。若過表達突變的SOS1?IT1?MRE 序列，或改用包含突變型SOS1?MRE 序列的熒光報告基因質粒，則無法觀察到熒光強度的上述變化。以上結果支持SOS1?IT1 及其宿主基因SOS1 之間存在由miR?124 介導的ceRNA調控機制。

SOS1基因的全稱為SOS Ras/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子1（SOS Ras/Rac guanine nucleotide exchange factor 1），其與鳥嘌呤核苷酸結合，使RAS 蛋白從無活性的GDP 結合體轉化為有活性的GTP 結合體，從而調控RAS 基因的功能，這一途徑是SOS1發揮癌基因活性的分子機制之一。若阻斷RAS 和SOS1 的相互結合，能夠減低癌基因RAS 的活性，避免RAS 突變體對GTP 相關信號通路的持續激活，起到抗細胞增殖的作用［19］。SOS1 突變體可能導致RAS 信號途徑的過度活化，促進肺癌細胞的增殖［20］。在筆者的前期研究中，通過基因芯片技術檢測發現，SOS1 在肝癌細胞中呈明顯的上調表達［7］，提示其在肝癌中可能發揮癌基因的活性。本研究主要關注SOS1 基因表達的上游調控機制，一方面發現了其內含子來源的lncRNA SOS1?IT1能夠促進肝癌細胞的活性和DNA 復制過程，另一方面證實了SOS1?IT1 能夠以ceRNA 機制正向調控SOS1 的表達。結合SOS1 基因的功能，推測SOS1?IT1 能夠通過ceRNA 機制輔助宿主基因SOS1 的表達，從而發揮癌基因的活性。這一結論不但為肝癌發生發展的分子機制提供了實驗依據，為開發抗肝癌藥物提供了可能的靶位點，對基因內含子的功能和可能的作用機制有進一步發現。