脂肪間充質干細胞及普蘭尼克F127水凝膠復合物對宮腔粘連子宮內膜的修復作用

祖珍玉 羅敏 申東翔 張科 李軍鵬 陳潔 吳琳 申博文

1廣州中醫藥大學（廣州510000）；2中國人民解放軍南部戰區總醫院（廣州510000）；3中山大學醫學院（廣州510000）

宮腔粘連是一種以子宮內膜損傷后宮腔前后壁部分或完全粘連為特征的婦科疾病［1］。IUA治療的主要目的是重建宮腔并恢復子宮內膜功能［2］。宮腔鏡下經宮頸粘連切除術（hysteroscopic transcervical resection of adhesion，TCRA）是宮腔粘連治療的標準方法，但術后粘連的高復發率和子宮內膜容受性下降所致的低妊娠率仍然是臨床中重度IUA 患者重點關注的問題［3-5］。

普蘭尼克F?127（Pluronic F?127，PF?127）是一種可吸收的生物相容性支架材料，具有包括固有的生物相容性、低抗原性和生物降解性等優異的生物學特性［6］。ADSCs 來源豐富，可通過分離、體外培養獲取且具有較強的分化能力［7］。越來越多的證據表明，脂肪間充質干細胞經過反復擴增后功能旺盛，其抗炎抗纖維化作用和低免疫原性能抑制干細胞凋亡并能刺激干細胞再生，可在未來作為IUA 潛在治療方法［8-9］。目前鮮有將ADSCs和PF?127 水凝膠復合物應用于中重度IUA 患者子宮內膜再生修復的研究。本研究通過建立與臨床IUA 致病因素相似的化學損傷IUA 模型，并通過構建ADSCs?PF?127 水凝膠復合物，探討其在體內治療效果及其可能修復作用機制，以期為解決中重度IUA 患者子宮內膜容受性下降的問題提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物普通級健康成年未孕雌性新西蘭大白兔65 只，兔齡6～8 周，體質量2.4～2.6 kg，購自廣東省醫學實驗動物中心［實驗動物許可證號：［SCXK（粵）2019?0023］。兔子宮組織取材和相關實驗于南部戰區總醫院實驗動物中心實驗室內進行［SYXK（粵）2019?0100］，通過動物實驗倫理審查（2019102502）。

1.2 主要試劑與儀器免疫組化試劑盒（Sigma，美國）；Masson 染色試劑盒（Sigma，美國）；BX?51 顯微鏡系統及數字圖像采集系統（Olympus，日本）；計算機圖像分析系統Image?ProPlus6.0（SilverSpring，美國）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪間充質干細胞負載PF?127 水凝膠復合物的制備兔脂肪間充質干細胞的分離、純化、培養與鑒定按LI 等［10］研究方法，選擇25%的PF?127凝膠溶液包裹ADSCs 進行細胞封裝，制備ADSCs?PF?127 水凝膠復合物以備后續實驗。

1.3.2 實驗分組及模型的制備選用25 只健康雌性普通級新西蘭大白兔并將其隨機分為假手術組、IUA 模型組、PF?127 水凝膠組、ADSCs 組、AD?SCs?PF?127 水凝膠復合物組，每組5 只。假手術組：打開腹腔，暴露雙側子宮，不對子宮作任何處理，關腹；IUA 組：用95%乙醇損傷一側宮腔30 s，關腹；PF?127水凝膠組：建立IUA 模型14 d后，隨機選取一側兔子宮，使用注射器沿該側子宮角長軸向腔內注入2 mL PF?127溶液，靜置1~2 min，以確保注入宮腔內的PF?127 溶液在生理溫度下已經由液態轉變為凝膠態；ADSCs 組：建立IUA 模型14 d后，隨機選取一側子宮，使用注射器沿該側子宮角長軸向腔內注入2 mL ADSCs 懸液（2×106個細胞）；ADSCs?PF?127 復合物組：建立IUA 模型后，隨機選取一側子宮，使用注射器沿該側子宮角長軸向腔內注入2 mL ADSCs?PF?127 水凝膠復合物；所有組別對側子宮均不予任何干預治療。干預治療術后，給予每組每只新西蘭白兔青霉素10 萬IU/日，連續腹腔注射3 d。

1.3.3 病理組織切片及染色各組新西蘭大白兔在干預治療14 d 后，開腹取出雙側子宮并分離，然后將分離出的子宮置于4%多聚甲醛浸泡固定后標準石蠟包埋，切成5 μm 切片以備后續蘇木精?伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色和Masson 染色實驗及免疫組化實驗。

1.3.4 子宮內膜腺體數量檢測兔子宮組織樣本的石蠟切片行HE 染色。將染色的切片在室溫下風干并用中性樹脂固定，然后，用顯微鏡觀察子宮的形態，計算腺體數量，并在每張切片上隨機選擇至少5 個高倍鏡視野圖像，計算平均值。

1.3.5 子宮內膜纖維化程度檢測兔子宮組織樣本的石蠟切片行Masson 染色檢測子宮內膜纖維化。應用圖像處理軟件Image?ProPlus 6.0 計算每個視野中子宮內膜間質及腺體總面積的比值，并在每張切片上隨機選擇至少5 個高倍鏡視野圖像，計算平均值。

1.3.6 子宮內膜厚度檢測兔子宮組織樣本的石蠟切片行HE染色和Masson染色。采用圖像處理軟件Image?ProPlus 6.0測量子宮內膜厚度，計算平均值。

1.3.7 免疫組織化學檢測兔子宮組織樣本的石蠟切片行免疫組織化學染色檢測TGF?β1的免疫表達量，采用圖像處理軟件Image?ProPlus 6.0 記錄每個視野子宮內膜腺上皮和腔內上皮的平均光密度（mean optical density，MOD），并在每張子宮切片上隨機選擇至少5個高倍鏡視野圖像，計算平均值。

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。符合正態分布和方差齊性的定量資料以均數±標準差表示，各組數據采用單因素方差分析及Tukey 事后多重比較進行分析，以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色評價損傷后子宮內膜腺體數目變化假手術組子宮內膜結構完整，IUA 模型組子宮內膜表面被扁平的低柱狀上皮細胞覆蓋，子宮內膜萎縮變薄、纖維化，上皮下有少量腺體，間質水腫并伴有宮腔粘連帶出現，PF?127 水凝膠組和AD?SCs 組子宮內膜稍增厚，ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組中腺體出現大量增生。與假手術組相比，IUA模型組子宮內膜腺體數目顯著下降（P< 0.05）；ADSCs 組和PF?127 水凝膠組子宮內膜腺體數目與IUA 模型組相比差異無統計學意義（P> 0.05）；而ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組子宮內膜腺體數目與IUA 模型組相比明顯增加（P<0.05），見圖1、表1。

圖1 各組兔子宮內膜腺體情況Fig.1 The endometrial glands of rabbits in each group

表1 各組子宮內膜腺體數目的分析比較Tab.1 Analysis and comparison of the number of endometrial glands in each group ±s

表1 各組子宮內膜腺體數目的分析比較Tab.1 Analysis and comparison of the number of endometrial glands in each group ±s

治療組別假手術組IUA 模型組PF?127 水凝膠組ADSCS 組ADSCs+PF?127 水凝膠組例數5 5 5 5 5子宮內膜腺體數目（個/HP）17.50±0.50 1.50±1.50 7.50±0.25 7.50±2.50 16.50±2.50 F 值30.25 P 值0.021

2.2 Masson染色評價損傷后纖維化增生的變化假手術組子宮內膜間質幾乎無膠原纖維沉積。IUA 模型組膠原纖維沉積增加，毛細血管充血水腫，間質有大量中性粒細胞浸潤，ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組子宮內膜膠原纖維沉積量較IUA 組明顯減少。通過檢測各組子宮內膜纖維化面積比率結果顯示，與假手術組相比，IUA 模型組纖維化面積比率顯著增加（P< 0.05）；PF?127 水凝膠組子宮內膜纖維化比率與IUA 模型組相比差異無統計學意義（P> 0.05）；ADSCs 組和ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組纖維化面積比率較IUA 模型組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2、表2。

表2 各組子宮內膜纖維化面積比的分析比較Tab.2 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

表2 各組子宮內膜纖維化面積比的分析比較Tab.2 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

治療組別假手術組模型組PF?127 水凝膠組ADSCs 組ADSCs+PF?127 水凝膠組例數5 5 5 5 5纖維化面積（%）4.20±0.32 59.60±3.68 35.09±4.37 29.45±3.54 4.32±0.57 F 值10.58 P 值0.002

圖2 各組兔子宮內膜纖維化情況Fig.2 The fibrosis of endometrium of rabbits in each group

2.3 HE 染色和masson 染色評價損傷后子宮內膜厚度變化在干預治療14 d 后測定各組兔子宮內膜厚度。結果顯示，與假手術組相比，IUA模型組子宮內膜厚度變薄（P< 0.05）；ADSCs 組和PF?127水凝膠組子宮內膜厚度與IUA 模型組相比差異無統計學意義（P>0.05）；ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組子宮內膜厚度與IUA 模型組相比明顯下降，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖3、表3。

圖3 各組兔子宮內膜厚度情況Fig.3 The endometrial thickness of rabbits in each group

表3 各組子宮內膜厚度分析比較Tab.3 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

表3 各組子宮內膜厚度分析比較Tab.3 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

治療組別假手術組模型組PF?127水凝膠組ADSCs組ADSCs+PF?127水凝膠組例數5 5 5 5 5子宮內膜厚度（μm）567.31±30.56 178.67±24.56 265.68±7.45 289.23±12.78 489.46±13.24 F值127.450.014 P值

2.4 免疫組織化學檢測為了更進一步量化各組宮腔粘連子宮內膜纖維化程度，在干預治療14 d后通過免疫組織化學實驗檢測TGF?β的免疫表達量。結果顯示，與假手術組相比，IUA模型組TGF?β的免疫表達量明顯升高（P< 0.05）；ADSCs 組和PF?127水凝膠組子宮內膜TGF?β 免疫表達很弱，與IUA模型組差異無統計學意義（P>0.05）；而ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組TGF?β 免疫表達量顯著低于IUA 模型組，差異具有統計學意義（P< 0.001），見圖4、表4。

表4 各組兔子宮內膜組織TGF?β 免疫表達水平分析比較Tab.4 Comparison of TGF?β immune expression levels in endouterine tissues of rabbits in each group ±s

表4 各組兔子宮內膜組織TGF?β 免疫表達水平分析比較Tab.4 Comparison of TGF?β immune expression levels in endouterine tissues of rabbits in each group ±s

治療組別假手術組模型組PF?127水凝膠組ADSCs組ADSCs+PF?127水凝膠組例數5 5 5 5 5 TGFβ?1免疫表達量0.01±0.00 0.04±0.01 0.03±0.02 0.02±0.01 0.05±0.02 F值0.21 P值<0.001

3 討論

宮腔粘連通常伴隨著正常子宮內膜的結構破壞，導致月經異常、不孕、反復流產和妊娠并發癥［11-14］。醫源性刮宮是子宮內膜功能層丟失的主要原因［12］。宮腔鏡粘連松解術和激素治療是去除宮腔內結締組織，重建子宮內膜的常用方法，但術后粘連高復發率仍然是臨床難題［15］。間充質干細胞由于具有豐富的可獲得性、自我更新和分化的潛力在再生醫學中顯示出巨大的應用潛力［14］。PF?127 水凝膠可成為細胞運輸載體，保證內膜修復過程中干細胞的有效濃度［16-18］。本研究通過構建ADSCs?PF?127 水凝膠復合物，比較評價其對化學損傷IUA 兔子宮內膜的修復作用，從而為中重度IUA 的治療提供新的思路。

注：干預治療14 d 后行免疫組織化學染色（×400）

在本研究中，經PF?127 水凝膠組干預治療后子宮內膜仍有膠原纖維沉積，僅有少量腺體增生，TGF?β 表達量上調，這說明僅用單獨PF?127 水凝膠治療不能使子宮內膜腺體大量增生和減輕子宮內膜纖維化；ADSCs 組子宮內膜間質仍有輕度纖維化，腺體數目下降，這說明ADSCs 在減少子宮內膜炎癥、增強腺體的增殖方面療效并不明顯。ADSCs?PF?127 水凝膠復合物組，宮腔形態基本恢復正常，纖維化程度明顯減低，腺體數目明顯增加，子宮內膜纖維化標志物TGF?β 較IUA 模型組明顯降低，這說明其對宮腔粘連子宮內膜纖維化及腺體的增殖均具有一定的改善作用。

綜上所述，脂肪間充質干細胞和PF?127 水凝膠聯合應用于新西蘭大白兔IUA 動物模型療效顯著，對其損傷子宮內膜厚度、腺體數量和纖維化程度均有一定的改善作用，ADSCs?PF?127 水凝膠復合物可以作為一種有效的治療方法，從而為進一步探討IUA 的病理機制提供基礎。