水稻萌發期激素信號轉導和谷胱甘肽代謝轉錄分析

崔歡 高巧麗 羅立新 楊靖 陳淳 郭濤 劉永柱 黃永相 王慧 陳志強,* 肖武名,*

水稻萌發期激素信號轉導和谷胱甘肽代謝轉錄分析

崔歡1高巧麗1羅立新1楊靖1陳淳1郭濤1劉永柱1黃永相2王慧1陳志強1,*肖武名1,*

(1華南農業大學國家植物航天育種工程技術研究中心，廣州 510642；2廣東海洋大學 濱海農業學院，廣東 湛江 524088；*通信聯系人，E-mail：chenlin@scau.edu.cn；heredity24@126.com）

【】利用轉錄組測序技術，探究水稻萌發過程中激素信號轉導和細胞內部氧化還原平衡的調控機理，以期增加對萌發過程中復雜調控機制的理解，促進萌發期基因組轉錄調控網絡的構建，并挖掘調控種子萌發的相關基因，為水稻直播稻新品種選育提供理論參考。利用萌發0、24和48 h的種子進行動態轉錄組測序分析，以差異倍數≥2、錯誤發現率≤0.05為閾值篩選差異基因，并利用Gene Ontology(GO)和KEGG Pathway數據庫對萌發不同階段的差異基因進行分析注釋；同時利用實時熒光定量PCR對測序結果進行驗證；最后運用String蛋白互作數據庫以combined_score≥0.9為閾值分析差異基因的蛋白互作網絡。在種子萌發前期鑒定到8719個差異基因，而在萌發后期僅鑒定到3480個。GO和KEGG富集結果均顯示與激素信號轉導相關的基因主要在萌發前期被誘導，特別是生長素信號轉導途徑中的GH3家族基因在萌發前期均受到顯著誘導；而谷胱甘肽代謝途徑中的基因在萌發后期轉錄更為活躍，其中谷胱甘肽-S-轉移酶基因富集最多。此外，兩個異檸檬酸脫氫酶基因在萌發過程中被顯著誘導，經蛋白互作預測發現兩個異檸檬酸脫氫酶基因與GH3家族基因可能存在相互作用。在種子萌發前期，生長素信號轉導途徑中的GH3家族基因可能在減弱生長素信號以及降低生長素活性方面發揮著重要作用，其高表達能降低生長素對種子的休眠作用，促進萌發啟動；在種子萌發后期，谷胱甘肽代謝途徑中的谷胱甘肽-S-轉移酶基因可能在細胞抵抗氧化脅迫中發揮主要作用；此外，在整個萌發過程中，GH3和異檸檬酸脫氫酶家族基因的相互作用可能在實現激素轉導途徑和谷胱甘肽代謝途徑的交互串聯作用、共同調控種子萌發方面具有重要意義。

水稻；萌發；轉錄組；激素；谷胱甘肽

水稻是世界上最重要的農作物之一，世界上超過一半的人口以水稻為主食[1]。近年來，隨著水稻免耕直播技術的廣泛應用以及機插秧比例的不斷增加，生產上對種子發芽特性的要求越來越高[2]。提高種子活力可以大幅縮短出苗時間，減小田間播種環境中的低溫和低氧等不良因素對種子發芽的抑制作用，提高發芽率和出苗整齊度，從而提高群體質量，實現播種后的高產、穩產和優質[3, 4]。

種子萌發是水稻生命周期的起始階段，開始于干種子吸水膨脹，結束于胚根的形成并突破種皮，決定了隨后的成苗效果。一般而言，種子萌發過程可分為快速吸水階段、吸水平臺期和再次快速吸水三個階段[5, 6]。先前研究表明，種子在快速吸水過程中，會因為膨脹過快、過度而出現損傷[7]，并且種子緊密的內部結構也會限制與外界環境的正常氣體交流，從而導致萌發早期的種子出現氧化脅迫。因此，種子在萌發過程中會激活一系列脅迫相關基因的表達來保障萌發的正常進行[8]。蛋白組學分析揭示了水稻種子在吸水膨脹過程中發生的主要代謝活動，包括細胞完整性的修復、DNA損傷的修復、氧化還原以及丙酮酸代謝等[9-12]。同時，隨著轉錄組測序技術（RNA-seq）的不斷發展與應用，一系列與氧化還原、信號轉導以及細胞壁完整性相關的基因在種子萌發過程中被鑒定出來[13, 14]。Chen等[15]在擬南芥種子萌發過程中發現編碼抗壞血酸過氧化酶6（ascorbate peroxidase 6，APX6）能調節活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號來保護種子免受過度的氧化損傷，并能通過與激素信號的串聯作用來促進種子萌發。He等[16]利用干種子和吸脹8 h的種子進行轉錄組測序，發現含有AP2（Apetala 2）結構域的轉錄因子在種子萌發初期的信號轉導過程中可能起著重要調控作用。

眾多研究表明，植物激素是調控種子萌發的重要因素，在種子萌發過程中激素信號轉導途徑會調節一系列蛋白質的合成與分解代謝，從而保證種子在合適的條件下啟動萌發[17]。其中，脫落酸（ABA）是種子萌發過程中的關鍵信號因子之一，其主要通過調節細胞壁的松動和膨脹來抑制種子萌發[18]。同時，ABA也能促進茉莉酸（JA）的生物合成來協同抑制種子萌發[19]。種子對ABA的敏感性決定了種子的發芽速率[20]，主要受ABA信號通路上PYR/PYL(pyrabactin resistance 1 / pyrabactin resistance 1-like)受體等3個核心組件的調控[21, 22]。Song等[23]發現基因能增強轉錄因子與啟動子的結合活性，促進ABA的信號轉導，從而抑制種子萌發。一般而言，生長素（AUX）能通過刺激ABA信號轉導來促進種子休眠，在萌發過程中也發揮著重要調控作用[24]。He等[25]利用構建的日本晴水稻突變體，發現水稻吲哚乙酸糖基轉移酶基因能通過調節種子萌發過程中AUX和ABA的含量，引起下游ABA信號因子表達變化，從而決定水稻種子活力水平。有研究表明，乙烯（ET）和油菜素內酯（BR）在種子萌發過程中可能起著促進作用[26]。

種子萌發是一個復雜的生理生化過程。目前，關于種子萌發過程中的基因表達調控已有諸多研究，但是信號轉導的準確調控機制以及氧化還原平衡如何穩定維持等問題仍然有待探索。本研究利用萌發0 h、24 h和48 h的種子進行動態轉錄組測序分析，以探索水稻種子萌發過程中不同發育階段的基因表達變化，旨在揭示不同萌發階段起主要調控作用的生物學途徑，并挖掘在萌發過程中起重要調控作用的關鍵基因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

供試材料為美國直播稻品種Francis，由華南農業大學國家植物航天育種技術研究中心收集。種子先用70%乙醇浸泡20 min進行表面消毒，后于10%的次氯酸鈉溶液中深度消毒30 min，蒸餾水洗滌三次后均勻放在鋪有兩層濾紙的直徑9 cm的培養皿中（加入10 mL蒸餾水），置于培養箱（25℃、12 h光照/12 h黑暗、濕度85%）中進行萌發。分別取萌發0 h（C0）、24 h（C1）和48 h（C2）三個階段的種子，30粒為1個重復，每個階段各取3個重復，用液氮快速冷凍后置于?80℃下保存備用。稱取冷藏的種子0.2 g，參照艾德萊試劑盒（AIDLA. RAN53）的指導說明書進行水稻總RNA提取。

1.2 測序文庫的構建與測序

測序文庫的構建與測序樣品檢測合格后，在北京百邁客生物科技有限公司用IIIuminaHiSeq平臺對構建合格的測序文庫進行雙末端測序。

1.3 測序結果質量分析

分別將各樣品的Clean Reads與指定的參考基因組（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）進行序列比對；獲得唯一比對上參考基因的reads（unique reads）；統計unique reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對結果是否通過第二次質控，判斷合格的高質量reads用于后續生物信息學分析。

1.4 差異表達基因的篩選與功能注釋

運用DESeq2軟件，以差異倍數（Fold Change，FC）≥2、錯誤發現率（False Discovery Rate，FDR）≤0.05為閾值，篩選出兩樣本間的差異表達基因（Differentially Expressed Gene，DEG），對基因表達模式進行上（下）調描述和統計。FDR值是通過對差異顯著性值（-value）進行校正得到的。

對篩選的差異基因運用ClusterProfiler分別進行生物學過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細胞組分（Cell Component，CC）的富集分析，并進行GO基因功能注釋，獲得所有差異表達基因的功能注釋、生物學功能以及相關的代謝途徑，并以值（-value）≤0.05為閾值找出顯著富集的分子條目。同時，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫，對篩選的差異基因進行通路（Pathway）定位和注釋分析，以≤0.05為閾值找出顯著富集的通路，進一步解讀基因的功能。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

分別采用艾德萊AIDLA.RAN53試劑盒和Promega公司的GoScript? Reverse Transcription System試劑盒提取總RNA并合成cDNA。在StepOne plus定量PCR儀上（美國ABI公司）開展實時定量PCR分析，所用試劑為南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)以及基于SYBRGreen染料法的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒。以（）基因為內參，引物序列信息如表1所示，定量數據處理參照Schmittgen等[27]的方法，每個基因進行3次生物學重復。

1.6 蛋白互作預測

利用String蛋白質互作數據庫(https://string- db.org/）中的互作關系以combined_score≥0.9為閾值分析差異基因蛋白互作網絡，并運用Cytoscape軟件繪制蛋白互作網絡圖。

2 結果與分析

2.1 不同階段DEG的鑒定和表達分析

在種子萌發過程中，總共鑒定到10 379個DEG。在萌發前期（C0 vs C1），共有8719個基因差異表達，其中4863個基因表達上調，3856個基因表達下調（圖1-A）；在萌發后期(C1 vs C2)，共鑒定到3480個DEG，其中有2185個基因表達上調、1295個基因表達下調（圖1-B）。萌發前期的差異基因數量顯著多于后期，尤其是前期表達上調的基因明顯多于表達下調的基因和后期表達上調的基因。共有1820個基因在萌發的兩個階段持續差異表達（圖1-C），其中703個持續上調表達，344個持續下調表達（圖1-D），它們可能在萌發過程中持續發揮重要作用。此外，有560個差異表達基因在萌發前期表達顯著上調，而在萌發后期又顯著下調，還有部分基因在萌發前期表達量顯著上升，而在萌發后期又顯著下降，暗示它們可能在萌發的不同階段發揮著不同的作用。

表1 差異表達基因qRT-PCR驗證引物

2.2 不同階段DEG的GO富集分析

為了了解水稻種子在萌發過程中DEG的主要功能特征，分別對每一階段的DEG進行GO顯著性富集分析。萌發前期共富集了37個GO分子條目，其中生物學過程、細胞組分和分子功能分別富集到21、13和3個條目（圖2-A）；在萌發后期，分別富集到28、19和30個條目（圖2-B）。

在萌發過程中，細胞氧化劑排毒、過氧化氫分解過程、氧化還原過程、氧化應激反應、幾丁質分解代謝過程以及基于微管的運動共6個生物學過程的條目在種子發育的兩個階段均顯著富集。在萌發前期，顯著富集到的主要包括脂肪酸生物合成過程、以DNA為模板的轉錄調控、DNA復制起始、對脫落酸的反應以及細胞周期等分子條目，主要與DNA復制、轉錄以及激素信號轉導等生物學過程有關。在種子發育后期，顯著富集到的生物學過程的條目主要涉及物質的合成與分解代謝、光合作用以及氧化還原等生物學過程，主要包括谷胱甘肽代謝過程、糖酵解過程以及跨膜轉運等。對分子功能進行分析后發現，在種子萌發前期只顯著富集到了金屬離子結合、過氧化物酶活性和脂質結合3個功能條目；而在種子萌發的后期，主要富集在幾丁質酶活性、過氧化物酶活性、谷胱甘肽轉移酶活性以及氧化還原酶活性等分子功能條目。

2.3 不同階段DEG的KEGG富集分析

為了探究水稻種子在萌發過程中的代謝途徑變化，利用KEGG數據庫對DEG進行了功能分類和通路注釋分析。由圖3可知，在萌發前期有4條KEGG通路顯著富集，在萌發后期有22條KEGG通路顯著富集，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝與半胱氨酸和蛋氨酸代謝兩條氨基酸代謝途徑在兩個階段均顯著富集。在萌發前期富集到

差異基因最多的通路是植物激素信號轉導途徑；而在萌發后期顯著富集的代謝通路主要包括碳代謝、淀粉和蔗糖代謝與谷胱甘肽代謝等13條代謝途徑，苯丙烷生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成等4條生物合成途徑，糖酵解/糖異生以及與光合作用有關的2條途徑等。

2.4 激素信號轉導途徑基因的表達模式分析

種子萌發過程中，在植物激素信號轉導途徑中共富集到與生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素內酯、茉莉酸和水楊酸在內的8大類激素轉導相關的107個DEG，其中在萌發前期富集到87個DEG，且58個基因的表達水平相比于干種子均顯著上調(圖4)。萌發后期富集到的基因明顯少于前期，只有38個，其中上調基因占24個。

A?萌發前期差異基因MA圖；B?萌發后期差異基因MA圖；C?萌發期差異基因韋恩圖；D?萌發期上（下）調差異基因韋恩圖。

C0?萌發后0 h; C1?萌發后24 h; C2?萌發后48 h。

A, MA map of DEG in early germination; B, MA map of DEG in late germination; C, Venn diagram of DEG in germination stage; D, Venn diagram of up-regulation and down-regulation DEG in germination stage.

C0, 0 h after germination; C1, 24 h after germination; C2, 48 h after germination.

圖1 不同萌發階段差異表達基因分析

Fig. 1. Differentially expressed gene analysis during different germination stages.

在種子萌發前期，與生長素轉運相關的4個基因均被顯著誘導，而生長素響應因子ARF(auxin response factor)基因更是上調10倍以上。生長素信號轉導的負調控因子Aux／IAA(auxin/indole acetic acid)、具有吲哚乙酸氨基酸化合成酶功能的GH3(Gretchen Hagen 3)相關基因以及編碼鈣調素結合蛋白的SAUR(small auxin up RNA)基因也大部分顯著上調表達，且在24 h表達上調的基因更為集中。說明在種子萌發前期，生長素信號轉導途徑中起負調控作用的基因轉錄更為活躍，生長素信號轉導強度在萌發期間可能有所降低。與AUX相關基因表達趨勢不同的是，ABA信號轉導途徑中的亞類Ⅲ蔗糖非發酵-1-相關蛋白激酶2(subclass Ⅲ sucrose nonfermenting-1-related protein kinase2，SnRK2)、A組2C類蛋白磷酸酶(group A type 2C protein phosphatase，PP2C)以及轉錄因子ABF(ABA-responsive element binding factor)相關基因的表達在種子吸脹后表達呈現明顯下降趨勢，暗示在種子萌發過程中與ABA信號轉導相關基因的轉錄受到明顯抑制。而ABA受體PYR/PYL基因在萌發前期表達量上升而在后期表達量又明顯下調，表明ABA信號轉導可能主要發生在種子萌發前期。ET信號轉導的負調控器CTR1相關的基因表達上調，而乙烯信號轉導的關鍵因子EIN2相關的基因以及下游的正調控器EIN3基因均表達下調，暗示種子萌發過程中對ET敏感性有所降低。

圖2 萌發前期(A)和萌發后期(B)差異表達基因GO富集分析

Fig. 2. GO enrichment plots of differentially expressed genes at early(A) and late(B) germination stages.

C0?萌發后0 h; C1?萌發后24 h; C2?萌發后48 h。

Fig. 3. KEGG enrichment plots of DEGs at different germination stages.

圖4 植物激素信號轉導途徑基因表達熱圖

Fig. 4. Heatmap of DEGs expression in hormone signal transduction pathways.

其他植物激素中，6個與BR信號轉導有關的基因在萌發前期均顯著上調，而在萌發后期的表達水平與前期相比無明顯變化，表明BR在整個萌發過程中可能起促進作用，且主要在前期響應萌發信號。CK、JA和SA信號途徑相關基因表達整體呈上升趨勢。與大部分激素信號轉導相關基因在萌發前期出現顯著上調的表達趨勢不同的是，CK信號轉導相關的基因在萌發后期比前期表達上調更為顯著和集中，可能與后期活躍的細胞擴增有十分密切的關系。

2.5 谷胱甘肽代謝途徑基因的表達模式分析

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）能猝滅細胞中的活性氧物質，是一種在植物中普遍存在的抗氧化劑。在種子萌發過程中總共有44個DEG富集在谷胱甘肽代謝途徑上，在萌發前期富集到28個DEG，包括13個上調表達的基因；在萌發后期富集到23個差異基因，且大部分基因的表達水平相比前期均呈顯著上升趨勢（圖5）。在萌發期間共有7個基因持續差異表達，其中有4個基因持續上調表達，包括2個GST基因。2個異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate Dehydrogenase，ICDH）基因在萌發前期的表達量相較于干種子均顯著上升，上調倍數更是達到了36倍以上。說明ICDH催化NADPH生成NADP+的同時釋放的能量可能在種子萌發前期發揮著重要的作用。該途徑中富集到的編碼谷胱甘肽-S-轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）的基因最多，達到23個，且大部分在萌發過程中被顯著誘導。此外，谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，GS)和谷胱甘肽水解酶相關基因在萌發后期也均被顯著誘導，谷胱甘肽代謝途徑相關基因在種子萌發過程中進行了積極響應，在萌發前期與后期上調和下調的基因有所不同。

2.6 激素信號轉導與谷胱甘肽代謝途徑對萌發的交互調控

運用String蛋白互作預測數據庫，將107個與激素信號相關的DEG和44個谷胱甘肽代謝途徑中的DEG進行蛋白互作預測，以combined_score≥0.9為閾值得到了如圖6所示的互作網絡圖。圖中共有10個簇，其中9個簇顯示的是與激素信號相關基因之間的互作關系，包括生長素轉錄因子基因（MP）與（IAA13）以及（IAA30）這兩個AUX/IAA轉抑制子基因之間的互作關系。前人研究表明，在生長素信號轉導的過程中，AUX/IAA蛋白對轉錄因子ARF具有抑制作用，能夠限制生長素響應基因的表達[28]。有趣的是，谷胱甘肽代謝途徑中的ICDH家族中的兩個基因（OsJ_02861）和（OsJ_19624）與生長素早期應答基因GH3家族的8個基因可能存在相互作用，結果表明植物激素信號轉導與谷胱甘肽代謝途徑可能通過ICDH和GH3家族基因實現串聯，在種子萌發中存在交互調控機制。

圖5 谷胱甘肽代謝途徑基因表達熱圖

Fig. 5. Heatmap of DEGs expression in glutathione metabolic pathway.

圖6 激素信號途徑基因與谷胱甘肽代謝途徑基因互作預測網絡圖

Fig. 6. Predicted interaction networks between hormone signaling transduction pathways and glutathione metabolic pathways.

C0?萌發后0 h; C1?萌發后24 h; C2?萌發后48 h。

Fig. 7. Expression patterns of selected DEG were verified by qRT-PCR.

2.7 部分DEG表達模式的qRT-PCR驗證

為了驗證轉錄組測序數據是否可靠，從鑒定到的GH3和GST兩個家族的差異基因中各自隨機挑選了4個進行了qRT-PCR驗證。結果表明8個DEGs的差異倍數雖然和測序結果不是完全一致，但是表達趨勢與測序結果均一致（圖7），表明轉錄組結果數據可靠。

3 討論

種子萌發是一個復雜的生物過程，干種子吸水后會啟動一系列轉錄活動，基因表達十分活躍。在本研究中，種子萌發前期的DEG顯著多于萌發后期，且大部分基因表達上調，暗示干種子吸水后，基因的表達量會顯著升高，且主要發生在萌發的前24 h，與前人研究結果基本一致[14]。GO富集發現，過氧化氫分解、對氧化應激的反應等生物學過程在整個萌發過程中均被顯著富集，說明在萌發過程中，氧化脅迫相關基因發揮著重要的作用。萌發前期被顯著富集的DEG主要與轉錄調控、DNA復制、對脫落酸的反應以及細胞周期等功能相關，說明萌發前期是基因轉錄以及信號分子發生劇烈變化的重要時期，該時期信號的轉導以及相應物質的準備決定著種子是否可以順利打破休眠，啟動萌發。在萌發后期，種子的轉錄應答主要涉及到物質的合成與分解代謝、光合作用以及氧化還原等生物學過程，可能與種子出芽階段的大量物質與能量需求有關。KEGG富集結果表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝與半胱氨酸和蛋氨酸代謝兩條氨基酸代謝途徑十分活躍，能為種子生命活動的進行提供充足的氨基酸，且其代謝產物也能為其他代謝途徑提供部分物質和能量支持，可能在種子萌發過程中起著舉足輕重的作用。萌發前期富集到DEG最多的通路是植物激素信號轉導途徑，表明與激素信號轉導相關的基因在種子萌發前期的信號響應中可能發揮著重要作用；而谷胱甘肽代謝途徑在萌發后期比前期富集更為顯著，則暗示在種子萌發后期可能仍舊存在著較為嚴重的氧化脅迫。

植物激素信號轉導途徑在種子萌發過程中起著重要的調控作用，其中，ABA和AUX均能通過特定的信號轉導途徑抑制種子萌發。在本研究中，與激素信號轉導相關的基因在種子萌發前期被顯著富集，暗示激素信號的轉導主要發生在種子萌發前期，并可能參與了種子前期的應激反應途徑。在ABA信號轉導途徑中，PYR/PYL受體能間接調控SnRK2的活性[29]；同時，當ABA與PYR/PYL受體結合后能觸發受體的構象變化，從而使受體-ABA復合物與PP2C結合并抑制其活性[30]。在本研究中，ABA受體PYR/PYL基因在萌發前期受到顯著誘導，而和基因在種子吸脹后均表達下調，另外8個轉錄因子在萌發過程中的轉錄也均受到明顯抑制，表明在萌發過程中ABA信號轉導減弱，ABA對萌發的抑制作用顯著降低。生長素信號轉導通路主要由生長素受體TIR1/AFB、轉錄抑制子AUX/IAA以及轉錄因子ARF三種因子組成[31]。在擬南芥中，基因的表達量下調會導致種子休眠水平的降低，加快萌發速率[24]。本研究中，僅鑒定到一個基因，其在吸脹后表達量大幅上升，而在生長素信號途徑中鑒定到的和相關差異基因數量較多，且大部分表達顯著上調，暗示在種子吸脹過程中，生長素信號轉導可能受到抑制，基因和可能共同調控生長素早期響應基因的表達。GH3家族中鑒定到的8個DEG在萌發前期均受到顯著誘導，、、和更是上調8倍以上。GH3蛋白能降低細胞中游離的生長素活性，抑制生長素信號轉導，可能在種子萌發早期能降低生長素對種子的休眠調控作用，促進種子萌發[32]。在本研究中，轉錄組數據顯示，種子萌發過程中乙烯信號轉導可能受到抑制，與前人報道不同[26]，這可能與不同的測試材料以及分析時期有關。

谷胱甘肽（GSH）能幫助維持細胞抗氧化防御，并且在調節細胞內氧化還原信號轉導中有著舉足輕重的作用，是一種在植物體內普遍存在且極為重要的抗氧化物質[33]。GST是具有多種功能的蛋白質家族，它們在酶促ROS清除機制中起重要作用，能以GSH為底物催化H2O2的轉化，從而產生氧化型谷胱甘肽（GSSG），GST過表達有助于提升非生物脅迫耐受性[34]。本研究在谷胱甘肽代謝途徑中富集到的23個編碼GST的DEG，且大部分在萌發過程中被顯著誘導，暗示GST家族基因可能通過維持細胞內的氧化還原平衡而在種子萌發過程中發揮作用。此外，和這兩個基因在萌發過程中受到顯著誘導。ICDH可以通過三羧酸循環為細胞質提供α-酮戊二酸，同時也可以產生谷胱甘肽還原酶和硫氧還蛋白還原酶的重要輔酶NADPH，與植物體內的ROS清除密切相關[35, 36]。兩個基因在萌發過程中持續表達上調，說明它們可能與萌發過程中細胞內氧化還原平衡的穩定維持以及能量代謝密切相關，在促進種子萌發過程的順利進行方面起著重要作用。谷胱甘肽代謝可能通過影響GSH/GSSG比率來平衡細胞中的ROS含量、催化H2O2的轉化，保護細胞免受氧化所導致的損傷；同時，其也可能通過合成與分解代謝參與調節細胞中的谷氨酸、半胱氨酸的含量，為其他代謝途徑提供部分物質基礎，在萌發過程中具有重要作用[37]。富集結果顯示在種子萌發前期和后期谷胱甘肽代謝途徑均被顯著富集，且在萌發后期富集更為顯著，暗示其在種子萌發的整個過程中起著重要的調控作用，尤其在保障種子從露白到發芽階段的順利過渡方面有著重要貢獻。

先前研究表明，植物激素信號轉導途徑和谷胱甘肽代謝途徑可能存在著多方向的交互作用，以保障植株對脅迫的有效應對[38, 39]。在擬南芥中，ABA能影響ROS的濃度[40]；而在水稻中，SA能調節GSH的濃度和GR的活性[41]。因此，本研究利用富集到的植物激素信號轉導途徑和谷胱甘肽代謝途徑中的差異基因進行了初步的蛋白互作預測，結果表明，GH3家族的基因和ICDH家族的兩個基因可能存在相互作用，它們可能將兩個代謝通路交互串聯起來，在水稻種子萌發過程中共同作用，確保種子萌發的順利進行。

4 結論

本研究利用RNA-seq技術對水稻干種子（0 h）、吸脹種子（24 h）以及發芽種子（48 h）進行了動態轉錄組分析。結果發現，植物激素信號的轉導主要發生在種子萌發前期，其中生長素信號轉導途徑中的GH3家族基因可能在降低游離生長素活性以及減弱生長素信號方面發揮著重要作用，其高表達能降低生長素對種子的休眠作用，促進種子萌發。而谷胱甘肽代謝途徑中的谷胱甘肽-S-轉移酶基因可能在種子萌發后期抵抗細胞氧化脅迫中發揮主要作用，并且萌發過程中該途徑里的異檸檬酸脫氫酶基因的高表達可能在實現與植物激素信號轉導途徑的串聯交互作用、共同調控種子萌發方面具有重要意義。

[1] Wei F, Droc G, Guiderdoni E, Hsing Y C. International consortium of rice mutagenesis: Resources and beyond[J]., 2013, 6: 39.

[2] Mahender A, Anandan A, Pradhan S K. Early seedling vigour, an imperative trait for direct-seeded rice: An overview on physio-morphological parameters and molecular markers[J]., 2015, 241(5): 1027-1050.

[3] Miura K, Lin S Y, Araki H, Nagamine T, Kuroki M, Shimizu H, Ando I, Yano M. Genetical studies on germination of seed and seedling establishment for breeding of improved rice varieties suitable for direct seeding culture[J]., 2004, 38(1): 1-5.

[4] Hsu S, Tung C. Genetic mapping of anaerobic Germination-associated QTLs controlling coleoptile elongation in rice[J]., 2015, 8: 38.

[5] Wang Z, Wang J, Bao Y, Wu Y, Zhang H. Quantitative trait loci controlling rice seed germination under salt stress[J]., 2011, 178(3): 297-307.

[6] Dametto A, Sperotto R A, Adamski J M, Blasi E A R, Cargnelutti D, de Oliveira L F V, Ricachenevsky F K, Fregonezi J N, Mariath J E A, Da Cruz R P, Margis R, Fett J P. Cold tolerance in rice germinating seeds revealed by deep RNAseq analysis of contrasting indica genotypes[J]., 2015, 238: 1-12.

[7] Mccormac A C, Keefe P D. Cauliflower (L.) seed vigour: imbibition effects[J]., 1990(7): 893-899.

[8] Weitbrecht K, Mueller K, Leubner-Metzger G. First off the mark:[J]., 2011, 62(10): 3289-3309.

[9] Yang P, Li X, Wang X, Chen H, Chen F, Shen S. Proteomic analysis of rice () seeds during germination[J]., 2007, 7(18): 3358-3368.

[10] He D, Han C, Yang P. Gene expression profile changes in germinating rice[J]., 2011, 53(10): 835-844.

[11] He D, Han C, Yao J, Shen S, Yang P. Constructing the metabolic and regulatory pathways in germinating rice seeds through proteomic approach[J]., 2011, 11(13): 2693-2713.

[12] He D, Yang P. Proteomics of rice seed germination[J]., 2013, 4: 246. Doi: 10.3389/fpls.2013.00246.

[13] Sano N, Ono H, Murata K, Yamada T, Hirasawa T, Kanekatsu M. Accumulation of long-lived mRNAs associated with germination in embryos during seed development of rice[J]., 2015, 66(13): 4035-4046.

[14] Wei T, He Z, Tan X, Liu X, Yuan X, Luo Y, Hu S. An integrated RNA-Seq and network study reveals a complex regulation process of rice embryo during seed germination[J]., 2015, 464(1): 176-181.

[15] Chen C, Letnik I, Hacham Y, Dobrev P, Ben-Daniel B, Vankova R, Amir R, Miller G. ASCORBATE PEROXIDASE6 protects arabidopsis desiccating and germinating seeds from stress and mediates cross talk between reactive oxygen species, abscisic acid, and auxin[J]., 2014, 166(1): 370-383.

[16] He Y, Zhao J, Feng D, Huang Z, Liang J, Zheng Y, Cheng J, Ying J, Wang Z. RNA-Seq study reveals AP2-Domain-Containing signalling regulators involved in initial imbibition of seed germination in rice[J]., 2020, 27(4): 302-314.

[17] Penfield S. Seed dormancy and germination[J]., 2017, 27(17): R874-R878.

[18] Gimeno-Gilles C, Lelievre E, Viau L, Malik-Ghulam M, Ricoult C, Niebel A, Leduc N, Limami A M. ABA-Mediated inhibition of germination is related to the inhibition of genes encoding Cell-Wall biosynthetic and architecture: Modifying enzymes and structural proteins in medicago truncatula embryo axis[J]., 2009, 2(1): 108-119.

[19] Wang Y, Hou Y, Qiu J, Wang H, Wang S, Tang L, Tong X, Zhang J. Abscisic acid promotes jasmonic acid biosynthesis via a 'SAPK10-bZIP72-AOC' pathway to synergistically inhibit seed germination in rice ()[J]., 2020, 228(4): 1336-1353.

[20] Shu K, Liu X, Xie Q, He Z. Two faces of one seed: Hormonal regulation of dormancy and germination[J]., 2016, 9(1): 34-45.

[21] Umezawa T, Nakashima K, Miyakawa T, Kuromori T, Tanokura M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular basis of the core regulatory network in ABA responses: Sensing, signaling and transport[J]., 2010, 51(11): 1821-1839.

[22] Nee G, Kramer K, Nakabayashi K, Yuan B, Xiang Y, Miatton E, Finkemeier I, Soppe W J J. DELAY of GERMINATION1 requires PP2C phosphatases of the ABA signalling pathway to control seed dormancy[J]., 2017, 8: 72.

[23] Song S, Wang G, Wu H, Fan X, Liang L, Zhao H, Li S, Hu Y, Liu H, Ayaad M, Xing Y. OsMFT2 is involved in the regulation of ABA signaling-mediated seed germination through interacting with OsbZIP23/66/72 in rice[J]., 2020, 103(2): 532-546.

[24] Liu X, Zhang H, Zhao Y, Feng Z, Li Q, Yang H, Luan S, Li J, He Z. Auxin controls seed dormancy through stimulation of abscisic acid signaling by inducing ARF-mediated ABI3 activation in[J]., 2013, 110(38): 15485-15490.

[25] He Y, Zhao J, Yang B, Sun S, Peng L, Wang Z. Indole-3-acetate beta-glucosyltransferase OsIAGLU regulates seed vigour through mediating crosstalk between auxin and abscisic acid in rice[J]., 2020, 18(9): 1933-1945.

[26] Corbineau F, Xia Q, Bailly C, El-Maarouf-Bouteau H. Ethylene, a key factor in the regulation of seed dormancy[J]., 2014, 5: 539.

[27] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod[J]., 2001, 25(4): 402-408.

[28] Dharmasiri N, Dharmasiri S, Estelle M. The F-box protein TIR1 is an auxin receptor[J]., 2005, 435(7041): 441-445.

[29] Soon F, Ng L, Zhou X E, West G M, Kovach A, Tan M H E, Suino-Powell K M, He Y, Xu Y, Chalmers M J, Brunzelle J S, Zhang H, Yang H, Jiang H, Li J, Yong E, Cutler S, Zhu J, Griffin P R, Melcher K, Xu H E. Molecular mimicry regulates ABA signaling by SnRK2 kinases and PP2C phosphatases[J]., 2012, 335(6064): 85-88.

[30] Cutler S R, Rodriguez P L, Finkelstein R R, Abrams S R. Abscisic acid: Emergence of a core signaling network[J]., 2010: 651-679.

[31] Chapman E J, Estelle M. Mechanism of Auxin-Regulated gene expression in plants[J]., 2009, 43(1): 265-285.

[32] Jain M, Kaur N, Tyagi A K, Khurana J P. The auxin-responsivegene family in rice ()[J]., 2006, 6(1): 36-46.

[33] Zagorchev L, Seal C E, Kranner I, Odjakova M. A central role for thiols in plant tolerance to abiotic stress[J]., 2013, 14(4): 7405-7432.

[34] Chi Y, Cheng Y, Vanitha J, Kumar N, Ramamoorthy R, Ramachandran S, Jiang S. Expansion mechanisms and functional divergence of the glutathione S-Transferase family in sorghum and other higher plants[J]., 2011, 18(1): 1-16.

[35] Jo S H, Lee S H, Chun H S, Lee S M, Koh H J, Lee S E, Chun J S, Park J W, Huh T L. Cellular defense against UVB-induced phototoxicity by cytosolic NADP(+)- dependent isocitrate dehydrogenase[J]., 2002, 292(2): 542-549.

[36] Jo S, Son M, Koh H, Lee S, Song I, Kim Y, Lee Y, Jeong K, Kim W B, Park J, Song B J, Huhe T. Control of mitochondrial redox balance and cellular defense against oxidative damage by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase[J]., 2001, 276(19): 16168-16176.

[37] Noctor G, Mhamdi A, Chaouch S, Han Y, Neukermans J, Marquez-Garcia B, Queval G, Foyer C H. Glutathione in plants: An integrated overview[J]., 2012, 35(2SI): 454-484.

[38] Moons A. Regulatory and functional interactions of plant growth regulators and plant glutathione S-transferases (GSTS)[J]//, 2005,72: 155-202.

[39] Miller G. Reactive oxygen signaling and abiotic stress[J]., 2010,133(3): 481-489.

[40] Murata Y, Pei Z M, Mori I C, Schroeder J. Abscisic acid activation of plasma membrane Ca2+channels in guard cells requires cytosolic NAD(P)H and is differentially disrupted upstream and downstream of reactive oxygen species production in abi1-1 and abi2-1 protein phosphatase 2C mutants [J]., 2002, 14(1): 287.

[41] Kusumi K, Yaeno T, Kojo K, Hirayama M, Hirokawa D, Yara A, Iba K. The role of salicylic acid in the glutathione-mediated protection against photooxidative stress in rice[J]., 2006, 128(4): 651-661.

Transcriptome Analysis of Hormone Signal Transduction and Glutathione Metabolic Pathway in Rice Seeds at Germination Stage

CUI Huan1, GAO Qiaoli1, LUO Lixin1, YANG Jing1, CHEN Chun1, GUO Tao1, LIU Yongzhu1,HUANG Yongxiang2, WANG Hui1, CHEN Zhiqiang1,*, XIAO Wuming1,*

(1National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2Binhai Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China;*Corresponding author, E-mail: chenlin@scau.edu.cn; heredity24@126.com)

【】By using transcriptome sequencing technology, we explored the regulation mechanism of hormone signal transduction and redox balance inside cells during rice germination, as a way to increase the understanding of and construct the complex regulatory network of germination.At the same time, mining the genes that regulate seed germination could lay a theoretical basis for direct-seeded rice breeding.【】Dynamic transcriptome sequencing analysis was performed using seeds at 0, 24, and 48 hours after imbibition as materials. Differentially expressed genes (DEGs) were screened with the threshold of Fold Change≥2 and False Discovery Rate≤ 0.05. Gene Ontology and KEGG Pathway databases were used to analyze and annotate the DEGs at different stages of germination and real-time quantitative PCR was conducted to verify the sequencing results. Finally, the protein interaction network of DEGs was analyzed using the String protein interaction database under the threshold of combined_score≥0.9.【】8719 DEGs were identified in the early stage of seed germination, but only 3480 DEGs in the late stage of germination. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that the DEGs related to hormone signal transduction were mainly induced in the early stage, especially the GH3 (Gretchen Hagen 3) family genes in the auxin signal transduction pathway were all significantly induced after imbibition. While the DEGs involved in the glutathione metabolism pathway were more active during the late germination period, and the glutathione-S-transferase genes were the most enriched in this pathway. In addition, two isocitrate dehydrogenase (ICDH) genes were significantly induced throughout the germination process. According to protein interaction prediction, the two ICDH genes may interact with the GH3 family genes.【】The GH3 family genes in the AUX signal transduction pathway may play an important role in attenuating the AUX signal and reducing the AUX activity in the early stage of seed germination. Their high expression levels reduce the regulatory effect of auxin on seed dormancy and promote seed germination. In the glutathione metabolism pathway, GST genes may play a major role in resistance to cell oxidative stress in the late stage of seed germination. In addition, the interaction between GH3 and ICDH family genes during the germination process may have important significance in realizing the tandem effect of hormone transduction pathway and glutathione metabolism pathway and co-regulating seed germination.

rice; germination; transcriptome; hormone; glutathione

10.16819/j.1001-7216.2021.200915

2020-09-23；

2021-03-04。

國家自然科學基金資助項目(31872885)；廣東省重點領域研發計劃項目(2020B020219004)；國家重點研發計劃資助項目(2017YFD0100100)。