人參皂苷Rh2對黑色素瘤B16細胞作用及機制研究

任 煜，劉婷婷，祁冰潔

(安慶醫藥高等專科學校，安徽 安慶 246052)

黑色素瘤是一種惡性的侵襲性腫瘤，黑色素瘤的發生率在所有皮膚癌中最低，但死亡率高[1]。具有高度惡化、預后差、易轉移、對化療藥物不敏感等特點，給人類的生命健康帶來極大的威脅[2]。人參皂苷Rh2(G-Rh2)是人參皂苷中抗腫瘤活性較強的物質之一，在治療肝癌、結腸癌、肺癌及胃癌等方面都表現出藥理作用[3]，但是在黑色素瘤的治療上鮮少有人報道。本研究選用小鼠黑色素瘤細胞B16作為研究對象，考察G-Rh2對B16細胞的作用, 并初步探討其中的機制，為進一步深入研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 小鼠B16黑色素瘤細胞(購自中國科學院上海細胞庫)；G-Rh2(純度>98%，購自成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM高糖培養基、胰酶、雙抗、PBS磷酸緩沖鹽溶液(均購自上海碧云天科技有限公司)；胎牛血清、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、DNA含量檢測試劑盒、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、Caspase-3活性測定試劑盒、Caspase-9活性測定試劑盒(均購自上海索萊寶生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)。

1.1.2 儀器 二氧化碳培養箱(美國Thermo 公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；JW-2019HR高速冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；SpectraMax iD3多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將裝有黑色素瘤B16細胞的凍存管從液氮中取出，迅速投入37 ℃水浴融化，來回晃動至細胞融化后盡快移出37 ℃水浴。然后置于離心機中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入適量的完全培養基重懸，把細胞懸液轉入含有完全培養基的培養瓶中，放入CO2培養箱(37 ℃，5%CO2)培養，顯微鏡下密切觀察細胞狀態，1～2 d更換培養基，待細胞培養至融合率達到80%～90%后，棄去培養基，加入適量PBS清洗，加入胰蛋白酶消化傳代培養。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期的黑色素瘤B16細胞，在顯微鏡下進行細胞計數，將細胞的濃度調整為1×105個/mL，隨后將細胞接種到96孔板中，每孔加入100 μL的細胞液，每孔細胞濃度為1×104個/孔，在培養箱過夜培養細胞，細胞貼壁生長后，棄上清，在96孔板中分別加入含藥的100 μL新鮮完全培養基，藥物的濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL，同時設有未加藥的空白對照組，分別培養24 h、48 h、72 h，將96孔板中的培養液吸棄，加入含CCK-8的混合液(CCK-8試劑和完全培養液的體積稀釋比例為1∶10)，37 ℃繼續孵育1 h后，在酶聯免疫檢測儀波長450 nm處檢測各孔的OD值，并計算細胞的增殖抑制率。實驗重復6次。計算公式為：

增殖抑制率=[1-(藥物組OD值-空白組OD值/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長的黑色素瘤B16細胞，用胰蛋白酶消化后，將細胞接種于6孔板中，在37 ℃，5% CO2的CO2培養箱中培養過夜。細胞貼壁生長后，棄培養基，PBS沖洗3次，更換含藥的培養液繼續培養，將其分5組：空白對照組、10 mg/mL組、20 mg/mL組、30 mg/mL組、40 mg/mL組。藥物處理48 h后，用胰蛋白酶消化，PBS沖洗3次，然后加入1 mL冷PBS洗滌，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm，4 ℃離心5 min，棄上清，重復3次；將細胞懸浮于1 mL Binding Buffer，300 g離心10 min，棄上清，再用1 mL Binding Buffer重懸細胞，將細胞濃度調整為1×106個/mL；每管加入100 μL的細胞(1×105個/mL)，然后每管加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光反應10 min；5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應15 min，加400 μL Binding Buffer，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。細胞凋亡率/%=早期凋亡率/%+晚期凋亡率/%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長的黑色素瘤B16細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，將細胞接種于6孔板中，在CO2培養箱中培養過夜，細胞貼壁生長后，棄培養基，PBS洗滌3次，更換含藥的培養液繼續培養，將其分5組：空白對照組、10 mg/mL組、20 mg/mL組、30 mg/mL組、40 mg/mL組。藥物處理48 h后，細胞用胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，將細胞濃度調整為(1～5)×106個/mL，取1 mL的細胞懸液離心，1000 g，離心3min；棄上清，70%預冷酒精混勻，4 ℃固定12～24 h。1000 g，離心3 min，去上清，1 mL PBS洗滌1次，1000 g，離心3 min，去上清。加入0.5 mL碘化丙啶染色液(染色緩沖液、RNaseA、碘化丙啶染色液以500:25:2.5配制為碘化丙啶染色液)，37 ℃避光孵育30 min，4 ℃避光孵育30 min，用流式細胞術檢測細胞周期的變化。實驗重復3次。

1.2.5 分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-9活性 用顯微鏡對黑色素瘤B16細胞的生長情況進行觀察，取對數生長的黑色素瘤B16細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，將其分5組：空白對照組、10 mg/mL組、20 mg/mL組、30 mg/mL組、40 mg/mL組。藥物處理48 h后，用胰蛋白酶消化，將細胞濃度調整為(1～5)×106個/mL，300 g，離心5 min，去上清，用PBS重懸，300 g，離心3 min，加入Lysis Buffer，在冰上孵育15 min，10000 g，離心1 min，通過Bradford法定量蛋白質濃度，調整樣品蛋白濃度為1.0 mg/mL。每組取50 μL的樣品蛋白，加入Caspase-3或Caspase-9 Substrate，37 ℃避光孵育4 h，酶標儀檢測405 nm的吸光度值。實驗重復3次。用藥物組與未加藥對照組的吸光度(OD)值來表示不同濃度藥物組Caspase-3和Caspase-9的活性。

1.3 統計學處理用SPSS 23.0軟件對數據進行分析處理，用Graphpadprism 7進行做圖。計量資料以“均數±標準差”來表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 G-Rh2對B16細胞增殖的影響不同濃度G-Rh2 (10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL)作用于B16細胞24 h、48 h和72 h后，與空白對照組比，隨給藥濃度升高和藥物干預時間延長B16細胞的細胞活力均有顯著降低，并且呈濃度依賴性和時間依賴性，見表1。可見，G-Rh2具有抗B16黑色素瘤細胞的潛在能力，值得進一步深入研究。

表1 在不同時間段下不同濃度G-Rh2作用于B16細胞的生長抑制率

2.2 G-Rh2對B16細胞凋亡的影響10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的G-Rh2作用B16細胞48 h后，與對照組相比，G-Rh2的10 mg/mL組B16細胞凋亡率沒有顯著的差異(P>0.05)，G-Rh2的其他各組能顯著誘導B16細胞凋亡，隨著濃度的增加，細胞凋亡率也在增加(P<0.05)，呈濃度依賴性，具有統計學意義，見圖1。明確了G-Rh2能夠誘導B16黑色素瘤細胞凋亡。

圖1 不同濃度的人參皂苷Rh2對B16細胞凋亡的影響

2.3 G-Rh2對B16細胞周期的影響10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的G-Rh2作用B16細胞48 h后，不同濃度G-Rh2均可影響B16細胞生長周期，與空白對照組相比，G0/G1期細胞增多，由空白對照組60.64%增加至40 mg/mL時的82.88%，G2/M期細胞減少，由空白對照組16.31%下降至40 mg/mL時的7.49%，見表2、圖2。G-Rh2誘導B16細胞周期阻滯于G0/G1期。隨著G-Rh2濃度的增加，這種作用越顯著，差異具有統計學意義。

表2 不同濃度G-Rh2作用下B16細胞48 h后細胞周期分布情況

圖2 不同濃度G-Rh2作用于B16細胞48 h后細胞周期分布情況

2.4 G-Rh2對B16細胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響隨著G-Rh2濃度的上升，Caspase-3、Caspase-9活性均明顯升高，且呈劑量依賴性，各組細胞中Caspase-3、Caspase-9活性與Control組比較差異均有統計學意義，見表3。表明G-Rh2能夠活化Caspase-3和Caspase-9，從而參與細胞凋亡的發生。

表3 不同濃度G-Rh2作用B16細胞48 h后caspase-3，caspase-9活性

3 討論

惡性黑色素瘤，多見于皮膚，是一種侵襲性很高的腫瘤，而且對于大多數傳統的治療方法都會產生抵抗能力。目前治療黑色素瘤的方法眾多,但其預后很差[4]，多數藥物在治療過程中反應率低且毒性非常顯著，所以大多數常規化療藥物在黑色素瘤治療中都失敗[5]。因此，迫切需要尋找一些新的有效安全的黑色素瘤藥物。

在20世紀60～70年代人們就已經發現并且認識到人參具有抗腫瘤的作用，能夠抑制某些惡性腫瘤。隨著大量的研究證明，人參中具有抗腫瘤作用的活性成分主要是人參皂苷類。人參皂苷主要存在于人參、三七等五加科人參屬植物中，是一類固醇類化合物[6]。G-Rh2 是從人參中提取分離得到的二醇型低糖鏈皂苷單體, 它具有抗炎、抗腫瘤及降血糖作用等作用[7]，G-Rh2 對癌癥患者病情的改善、生活質量的提高、生命的延長等都具有重要作用。G-Rh2對很多種腫瘤細胞都具有抑制作用，像肺癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌等。隨著國內外研究的深入，學者發現G-Rh2主要是通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡分化；能夠提高機體對腫瘤的免疫力，增強免疫活性；抵抗腫瘤細胞的轉移與侵襲；抑制腫瘤血管的形成等[8]方面來產生抗腫瘤的作用。本實驗運用CCK-8檢測不同濃度的G-Rh2對B16細胞增殖的影響，結果顯示，隨G-Rh2濃度升高和G-Rh2干預時間延長，與空白對照組比，對B16細胞的抑制率均有顯著升高，并且呈濃度依賴性和時間依賴性。表明G-Rh2能夠抑制B16細胞增殖，說明G-Rh2具有抗B16黑色素瘤細胞的潛在能力。

誘導細胞凋亡是治療腫瘤非常重要的途徑之一，腫瘤細胞凋亡是為了維持內環境的穩定，由基因表達調控的細胞自主有序的死亡。有研究發現，腫瘤的發生、發展及轉移都與腫瘤細胞凋亡有密切關系[9]。當細胞出現凋亡，它的細胞體積會縮小，細胞核的核質會發生濃縮、核仁碎裂、深染，凋亡小體等變化。本實驗采用Annexin V-FITC/PI雙染的方法，運用流式細胞術檢測G-Rh2對B16細胞細胞凋亡的影響，與空白對照組相比，隨著G-Rh2的濃度增加，B16細胞的凋亡率也升高，呈濃度依賴性。表明G-Rh2能夠顯著增加B16細胞的凋亡率，說明G-Rh2能夠誘導B16黑色素瘤細胞凋亡。

細胞周期阻滯是誘導細胞死亡的機制之一，細胞的凋亡與其周期變化密切相關，細胞周期的全過程受到G1、S、G2、M等檢查點的嚴格控制，當這些檢查點發生改變就會導致細胞異常增殖，并且向癌癥發生發展，這些檢查點出現缺陷會導致腫瘤細胞無限增殖。很多抗腫瘤細胞能夠在在特定的檢測點誘導細胞周期阻滯，從而誘導細胞凋亡[10]。本實驗采用流式細胞術檢測G-Rh2對B16細胞細胞細胞周期的影響，不同濃度G-Rh2均可影響B16細胞生長周期，與空白對照組相比，G0/G1期細胞增多，G2/M期細胞減少，隨著G-Rh2濃度的增加，這種作用越顯著，表明G-Rh2誘導B16細胞周期阻滯于G0/G1期。

Caspase家族存在于細胞質的溶膠中，是一組結構相關的半胱氨基酸家族，也是促進凋亡的關鍵酶。大多數細胞凋亡通路都會匯合成一個可激活的Caspase的中心死亡信號，除少數非Caspase依賴性的通路[11]。Caspase家族中Caspase-9，Caspase-3在凋亡中具有重要的地位，Caspase-9是重要的啟動分子，Caspase-9位于凋亡級聯反應的上游，它可以自我活化或者與其他Caspase相互活化，激活下游的其他Caspase蛋白并且起著逐級放大作用，從而啟動凋亡[12]。Caspase-3是重要的執行分子，當接受信號后啟動凋亡。終末效應酶Caspase-3無論是哪一種途徑都將被激活，產生一系列級聯反應，促使細胞凋亡，所以說Caspase-3有“死亡蛋白酶”之稱[13]。本實驗采用分光光度法檢測Caspase-9、Caspase-3蛋白的活性，結果發現，與空白對照組相比，隨著G-Rh2濃度的升高，Caspase-9、Caspase-3活性也越來越高，且呈劑量依賴性。G-Rh2可能是通過激活Caspase家族，干預了Caspase-9、Caspase-3蛋白活性，促進了B16細胞的凋亡。

綜上所述，G-Rh2可有效抑制黑色素瘤細胞B16的增殖，并且促進體外培養的黑色素瘤細胞B16凋亡，G-Rh2誘導B16細胞凋亡有可能與激活Caspase信號通路有關。這顯示了G-Rh2在惡性黑色素瘤治療中具有潛在應用價值，但G-Rh2誘導凋亡的具體途徑以及藥物作用的靶點仍有待深入探討。