民族藥黑骨頭藥材杠柳毒苷含量測定的方法研究

楊勇幫 李健田 白玥

【摘要】目的：建立系統、科學的黑骨頭中杠柳毒苷的提取和含量測定的方法，為黑骨頭的質量控制提供方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動相為水-乙腈;流速為1.0mL/min;檢測波長為220nm;柱溫為25℃。結果：黑骨頭中杠柳毒苷的峰得到有效的分離，HPLC檢測條件、方法的專屬性、線性、重復性、精密度、穩定性、回收率良好，該方法可以用于杠柳毒苷的含量測定。結論：該方法為黑骨頭的質量控制和評價提供了參考依據。

【關鍵詞】黑骨頭;杠柳毒苷;高效液相色譜法;含量測定

【中圖分類號】R29【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）18-0031-04

Study on the Standard Content Determination of Chinese Herbal Medicine Periploca CalophyllaYANG Yongbang1LI Jiantian1BAI Yue2

1.Yuxi Institute for food and drug control，Yuxi 653100，China;2.Puer college，Puer 665000，ChinaAbstract：Objective To establish a systematic and scientific method for the extraction and determination of periplocin in Periploca calophylla，and to provide a reliable method for scientific evaluation and effective control of the quality of Periploca calophylla.Methods HPLC was used. The column was Agilent venusil plot-c18 （4.6mm×150mm，5 μm）; the mobile phase was water acetonitrile; the flow rate was 1.0mL/min; the detection wavelength was 220nm; the column temperature was 25℃.Results the HPLC detection conditions，specificity，linearity，repeatability，precision，stability and recovery rate were good. The method can be used for the content determination of Periplocoside.Conclusion this method provides a reference for the quality control and scientific evaluation of Periploca calophylla.

Keywords：Periploca calophylla; Periplocin; HPLC; Content Determination

民族民間用藥是中華傳統醫藥的重要組成部分，其歷史悠久并具很強的地域性。黑骨頭為云南省哈尼族、彝族常用藥材[1]，別名有鐵骨頭、牛尾蕨、青蛇膽、黑龍骨、青風藤等。主要用于腰痛、風濕麻木、跌打損傷及蛇咬傷的治療。黑骨頭最早是《云南省藥品標準》（1974）[2]収載品種，現為《云南省中藥材標準》（2005年版）[3]収載品種;其植物來源為蘿藦科植物黑龍骨Periploca forrestii Schltr.及青蛇藤Periploca calophylla （Wight） Falc.的干燥老莖和根。《云南省中藥材標準》（2005年版）黑骨頭藥材標準項下初步制訂了名稱、來源、性狀、薄層鑒別、檢查（水分、總灰分）、浸出物等項目，但沒有對其指標成分進行定性和含量測定;難以控制藥材的質量，無法保證臨床用藥的安全性和有效性。因此完善和提高黑骨頭藥材質量標準顯得非常有必要。

現代對黑骨頭藥材的研究，更多的是對植物黑龍骨的成分研究[4-6];而對植物青蛇藤的研究非常少見，僅見《青蛇藤化學成分研究》《青蛇藤正丁醇部分苷類成分的分離與鑒定》等文獻。現有的文獻報道，黑骨頭的研究多集中在化學成分、總皂苷、總黃酮及槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量測定和藥理作用等方面，未見關于黑骨頭和杠柳毒苷定性鑒別及含量測定方法的研究報道[7] 。對于黑骨頭藥材質量標準研究，特別是采用HPLC方法測定青蛇藤中杠柳毒苷的含量研究，目前尚無相關研究的文獻報道。因此，本實驗確定以強心苷類具有促進傷口愈合作用的杠柳毒苷作為控制指標，對黑骨頭藥材中杠柳毒苷成分的含量進行測定，并對其方法進行驗證，以便能更全面地分析評價其藥材質量和安全性。為民族藥黑骨頭的質量標準控制提供參考，同時也為黑骨頭藥材及相關制劑進一步研究和開發提供科學依據。

1儀器與材料

1.1儀器ME403E 103型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、CPX5800H-C型超聲清洗儀（必能信超聲（上海）有限公司）、BP211D型電子天平（賽多利斯）、DHG-9140A型鼓風干燥箱（上海合恒儀器有限公司）、1260 Infinity型高效液相色譜儀（安捷倫科技）、粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）、MS204型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、Cavy 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計（安捷倫科技）、DESA6A薄層色譜板成像儀。

1.2材料杠柳毒苷對照品（純度：98%，CAS No.13137-64-9，成都普瑞法科技開發有限公司）純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），三氯甲烷、丙酮、甲醇、無水乙醇、95%乙醇均為四川西隴科學有限公司，30%乙醇、45%乙醇、70%乙醇（現配現用，均用無水乙醇和純凈水配制），乙腈（色譜純，四川西隴科學有限公司），所用試劑除乙腈外均為分析純，并且均在有效期內。

云南地產藥材黑骨頭，經玉溪市食品藥品檢驗所副主任中藥師牟娟鑒定為蘿藦科植物青蛇藤Periploca calophylla（Wight） Falc.的干燥莖切片。

2方法與結果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1溶液的制備供試品制備：將黑骨頭樣品粉碎成粗粉，過2號篩，取藥材粉末約2g，加入甲醇25mL，超聲提取30min，將濾液過濾后放在恒溫水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為供試品溶液。對照品溶液制備：取杠柳毒苷對照品適量，加入甲醇溶解制成1mg/mL溶液，作為對照品試液。

2.1.2薄層色譜鑒別照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部[8]）試驗，分別吸取供試品溶液10μL，杠柳毒苷對照品溶液20μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，將薄層板置于展開缸中預飽和15min，以三氯甲烷：丙酮：水（10∶3∶1）為展開劑上行展開，展開，取出，揮干溶劑，噴以5%硫酸乙醇溶液并在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別又置于紫外光燈（365 nm）下視檢。供試品色譜中在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點和熒光斑點。可以初步確定黑骨頭藥材中含有杠柳毒苷。結果見圖1、圖2。

2.2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：以水為流動相A，乙腈為流動相B，按表1所示流動相洗脫程序;柱溫25℃：檢測波長220nm，流速1mL/min。對照品及供試品色譜圖如圖3、圖4所示。

2.2.2對照品溶液的制備取杠柳毒苷對照品適量，精密稱定，加45%乙醇溶液制成每1mL含0.207mg的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備精密稱取黑骨頭粉末約2g，置于錐形瓶中，精密量取45%乙醇25mL加入至錐形瓶，稱定重量。置于超聲提取30min，再次稱重，補足減失的重量后過濾，取續濾液作供試品溶液備用。

2.2.4檢測波長的確定將制備好的對照品溶液取適量置于比色皿中，放入Cavy 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計中進行全波長掃描，最終確定杠柳毒苷最大吸收波長為220nm。

2.2.5線性關系的考察稱取杠柳毒苷對照品10.57mg至50mL容量瓶中，加入45%乙醇溶液至刻度，即得到濃度為0.207mg/mL的對照品儲備溶液。取杠柳毒苷對照品儲備溶液25mL至100mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液。取1mL濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0052mg/mL杠柳毒苷溶液;取2mL濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0104mg/mL杠柳毒苷溶液;取5mL濃度為0.052mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶45%乙醇溶液至刻度，得到0.026mg/mL杠柳毒苷溶液;取5mL濃度為0.207mg/mL杠柳毒苷溶液至10mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.104mg/mL杠柳毒苷溶液;再取0.052、0.207mg/mL的對照品溶液，共計6個不同濃度的對照品溶液，按色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱;以水為流動相A，乙腈為流動相B按表1所示流動相洗脫程序;柱溫25℃：檢測波長220nm，進行高效液相色譜分析，以進樣濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程Y=6225X+0.2665，R2=0.9999，在0.005mg/mL～0.207mg/mL濃度范圍內，線性關系良好。

2.2.6精密度試驗取“2.2.2”項下對照品溶液按“2.2.1”色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果杠柳毒苷峰面積RSD值為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7重復性試驗按供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀中進行測定峰面積，計算含量得平均含量為0.5717 mg/g，RSD值為1.4%，表明方法重復性良好。

2.2.8穩定性試驗取供試品溶液，分別在室溫0h、4h、6h、8h、12h、18h、24h的時間下按“2.2.1”色譜條件進行測定峰面積，RSD值為0.59%。表明供試品在24h內穩定。

2.2.9加樣回收率試驗精密稱定已知含量（0.5717mg/g）的供試品6份至不同的錐形瓶中，精密加入杠柳毒苷對照品溶液（0.207mg/mL）3mL ，照供試品溶液的制備方法制備。取上述6份供試品溶液分別進樣10μL，測定其峰面積并計算含量。根據（《中國藥典》2015版四部）分析方法驗證指導原則準確度計算方法（用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量），即計算加樣回收率=（實測含量-所取樣品含量）/加入對照品量×100%）及RSD值。結果：平均回收率為99.1%，RSD為0.94%，表明該HPLC檢測條件、方法的可靠性強。如表2所示。

2.2.10樣品測定取3批樣品，分別取2 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，進樣。按色譜條件進行測定峰面積，計算含量結果見表3所示。

3結論與討論

通過按本試驗方法條件進樣考察，表明線性關系良好、儀器精密度良好、方法重復性良好、供試品溶液在24 h內基本穩定，本方法所測的黑骨頭藥材樣品中的杠柳毒苷含量為0.5717mg/g（0.057%），根據（《中國藥典》2015版四部）中對高效液相色譜法回收率的要求，其在85%～90%至108～110%之間均符合標準規定。本次加樣回收試驗杠柳毒苷的回收率為99.1%，在標準規定允許范圍內。表明該方法準確、可靠，對今后黑骨頭藥材的質量控制和科學評價提供了參考依據。通過前期的實驗考察，采用不同的柱溫分別觀察色譜柱的分離能力，最終確定柱溫25℃分離度最好。以水為流動相A，乙腈為流動相B，不同梯度洗脫程序進行驗證，最終確定洗脫程序。經過多次實驗，最終確定使用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果好、達到實驗要求。

通過對黑骨頭藥材的初步研究，發現云南習用的黑骨頭藥材來源大多是蘿藦科植物青蛇藤的干燥老莖。通過查閱相關文獻及采用薄層色譜鑒別方法，并與杠柳毒苷對照物質的比較，初步確定了藥材青蛇藤中含有杠柳毒苷，為后續采用高效液相色譜法測定杠柳毒苷含量奠定了物質基礎，同時為完善及提高黑骨頭藥材標準打下堅實的基礎。

參考文獻

[1]昆明民間常用草藥[M].昆明：昆明市衛生局出版，1970：364-365.

[2]云南省藥品標準（1974）[M].昆明：云南省衛生局出版，1974：327.

[3]云南省中藥材標準（2005年版）（第七冊）[M].昆明：云南科技出版社，2013.

[4]田俊生，李天祥，劉虹，等.HPLC法測定不同產地香加皮中杠柳毒苷的含量[J].藥物分析雜志，2002，22（6）：432-435.

[5]張宏，袁德彬，趙愛萍.HPCL法測定不同產地黑骨藤中杠柳苷的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（2）：241-244.

[6]甘秀海，周欣，趙超，等.不同產地及不同部位黑龍骨中杠柳毒苷質量分數變化[J].西南大學學報（自然科學版），2017，39（2）：8.

[7]王強，韓隆胤，魏賑權，等. 《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中黑骨藤化學鑒定方法之商榷[J].湖南中醫雜志，2019，35（11）：112-114.

[8]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部） [M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：59-61.（收稿日期：2021-05-19編輯：劉斌）

基金項目：全國中藥特色技術傳承人培訓項目（T20194828003）。

作者簡介：楊勇幫（1978-），男，漢族，副主任藥師，研究方向為民族藥質量控制及天然藥物鑒定分析。E-mail：122199214@qq.com通信作者：