青錢柳內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物抗氧化活性研究

胡世一 周雅琴 安寧 石忠衡 趙立春 譚小明

【摘要】目的：分析廣西產(chǎn)瀕危藥用植物青錢柳內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的抗氧化活性，篩選具有抗氧化活性較強的內(nèi)生真菌菌株。方法：以課題組前期已分離培養(yǎng)的131株青錢柳內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提取物為研究對象，對發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH·、·OH-、O-2·、NO-2能力和Fe2+螯合能力進行檢測。結(jié)果：結(jié)果表明，青錢柳內(nèi)生真菌表現(xiàn)出具有一定清除DPPH·、·OH-、O-2·、NO-2能力和Fe2+螯合能力，對DPPH·、·OH-、O-2·、NO-2最大清除率和對Fe2+最大螯合率分別為81.32 %、87.83 %、49.7 %、43.5 %、82.24 %;菌株824F、894F、907F、885F、890F、876F、912F清除·OH-自由基能力較強，清除率均大于陽性對照VC。結(jié)論：結(jié)果表明青錢柳內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性，可作為尋找新型天然抗氧化劑的潛在資源。

【關(guān)鍵詞】青錢柳;內(nèi)生真菌;代謝產(chǎn)物;抗氧化活性

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）18-0016-05

Study on the Antioxidant Activity of Secondary Metabolites from Endophytic Fungi of Cyclocarya paliurus （Batal.） IljinskHU Shiyi1ZHOU Yaqin1，2*AN Ning1SHI Zhongheng1ZHAO Lichun1TAN Xiaoming1，3*

1.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China;2.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant，

Nanning 530023，China;3.Guangxi Engineering Technology Research Center of Advantage Chinese Patent

Drug and Ethnic Drug Development，Nanning 530200，ChinaAbstract：Objective To analyzethe antioxidant activity of Cyclocarya paliurus（Batal.） Iljinsk，an endangered medicinal plant from Guangxi，the secondary metabolites of endophytic fungi from C.paliurus were screened.Methods The antioxidant activity of the secondary metabolites of 131 endophytic fungi from C.paliurus were detected by analyzing the ability of DPPH ·，·OH-、O-2·、NO-2 and chelating Fe2+.Results The results showed that the extracts from endophytic fungi of C.paliurus had the ability of scavenging DPPH ·，·OH-、O-2·、NO-2 and chelating Fe2+，and their maximum scavenging rates were 81.32%，87.83%，49.7%，43.5% and 82.24%，respectively. The seven isolates including 824F，894F，907F，885F，890F，876F and 912F had stronger scavenging ability of OH radicals，and the scavenging rates were higher than that of the positive control VC.Conclusions The results showed that the metabolites of endophytic fungi of C.paliurus had good antioxidant activity and could be used as a potential resource for new natural antioxidants.

Keywords：Cyclocarya paliurus; Endophytic Fungi; Metabolites; Antioxidant Activity

人體在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，如過氧化自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等，它們是人體疾病、衰老和死亡的直接參與者，一般情況下，當體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除能力處于平衡狀態(tài)時，受控的自由基對人體是有益的，一旦失衡，體內(nèi)就會出現(xiàn)“氧化應(yīng)激”狀態(tài)，這時則需要通過補充抗氧化劑來調(diào)整體內(nèi)自由基平衡，以防止疾病的發(fā)生[1]。日常中，被廣泛應(yīng)用于化妝品、保健食品和藥物中的抗氧化劑多為人工化學合成制品，存在有諸多毒副作用，難以滿足人們的生活需求[2]。

內(nèi)生真菌是指生活在健康植物組織器官內(nèi)部，但不會引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的一類真菌，包括一些在其生活史的某一階段表面生的腐生菌、潛伏性病原菌和菌根菌[3]。人們對內(nèi)生真菌的研究始于1993年，美國科學家Stierle首次從太平洋短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）韌皮部中獲得1株能夠生產(chǎn)抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae[4]。近年來的研究[5]顯示，內(nèi)生真菌能提高宿主植物對非生物脅迫與生物脅迫的抗逆性，部分內(nèi)生真菌能自身產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的活性成分物質(zhì)。因此，從植物中分離和篩選出具有抗氧化活性的內(nèi)生真菌，對食品、醫(yī)藥等工業(yè)具有重要意義。

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.） Iljinsk.系胡桃科青錢柳屬植物，又名青錢李、山麻柳、山化樹、一串錢、山麻柳、甜茶樹等，為我國特有的單種屬珍稀植物，有植物界大熊貓和醫(yī)學界的“第三顆樹”以及“天然胰島素”的美譽，其樹皮、葉具有清熱消腫、止痛功效，可用于頑癬，集綠化、保健、藥用、材用于一體[6]。研究[7]表明，青錢柳組織中含有黃酮類、酚類、萜類等多種化學成分，具有抗氧化、抗菌及抗腫瘤等活性作用。青錢柳不同溶劑提取物對DPPH、超氧、羥自由基均具有不同強度的清除能力[8]，青錢柳葉70 %乙醇提取物具有較好的抗氧化活性，一些成分的體外抗氧化活性強于VC[9]。但是，現(xiàn)階段國內(nèi)外有關(guān)青錢柳內(nèi)生真菌的研究報道尚少。研究以青錢柳內(nèi)生真菌為研究對象，篩選出活性較高的菌株并加以分類鑒定，旨在為尋找新型天然抗氧化劑提供可利用的候選菌株資源。

1材料與方法

1.1材料植物材料于2019年4月采自廣西百色市樂業(yè)縣雅長鄉(xiāng)（E 106°20′;N 24°84′），由廣西中醫(yī)藥大學譚小明研究員鑒定為青錢柳C.paliurus。131株內(nèi)生真菌分別從青錢柳的根、莖皮等組織中分離獲得。以上材料采保藏于廣西中醫(yī)藥大學藥學院。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵液制備在無菌超凈工作臺上，采用PDA平板培養(yǎng)基活化真菌7d，然后用接種針挑取3個菌塊（直徑為6mm），接種到含100mL PDA液體培養(yǎng)基錐形瓶（250mL）中，在轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床上震蕩暗培養(yǎng)10d（培養(yǎng)溫度為25℃）。發(fā)酵液用4層無菌的干凈紗布過濾。將濾液于10，000r/min條件下離心10min，取上清液于45℃，8×103Pa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏狀，稱重，加無菌去離子水配成10mg/mL 的樣品溶液，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2DPPH自由基清除率測定DPPH法快速、簡便、重現(xiàn)性好，自由基DPPH·在有機溶劑（如甲醇、乙醇）中非常穩(wěn)定，顯紫色，在517nm波長處有強吸收，DPPH溶液與自由基清除劑混合時，顏色由紫色變成淺黃色。參考文獻的方法[12]，以Vc作陽性對照，檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·自由基清除能力。清除率的計算公式如：DPPH清除率（%）=[（A0-Ai）/A0]×100，式中：A0為空白對照OD值，Ai為樣品或陽性對照DPPH溶液的OD值。

1.2.3羥基（·OH-）自由基清除能力測定OH是毒性最大的活性氧自由基，會引起脂質(zhì)過氧化作用及造成人體損傷。利用Fenton反應(yīng)體系法[12]，以Vc作陽性對照，在510nm處檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物清除·OH-的能力，清除率的計算公式同1.2.2。

1.2.4亞鐵離子（Fe2+）螯合能力測定鐵具有高反應(yīng)活性，能促使機體發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，對亞鐵離子的螯合，可以減少氧化損傷。采用Ferrozine（菲啰嗪）比色法[12]，以EDTA-2Na作陽性對照，在562nm處檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對亞鐵離子的螯合能力，對亞鐵的螯合率計算公式如：Fe2+螯合能力清除率（%）=[（A0-Ai）/A0] × 100，式中：A0為空白對照的OD值，Ai為加有樣品或陽性對照后的OD值。

通過1.2.1-1.2.4方法，綜合篩選出18株活性較好的菌株，作為深入研究對象，進行以下2種抗氧化活性指標的實驗。

1.2.5超氧陰離子（O-2·）清除能力測定O-2·是機體壽命最長的自由基，除自身能發(fā)生氧化反應(yīng)的外，還能引發(fā)產(chǎn)生其他自由基，繼而對機體造成更大的危害。參照鄰苯三酚自氧化法[10]，以VC作陽性對照，在536nm處檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物清除O-2·的能力，清除率的計算公式如：O-2·清除率（%）=[1-（Ai-A0）/（Ab-A0）]×100，式中：A0為不加 NBT 的OD值;Ab為空白對照的OD值;Ai為樣液的OD值。

1.2.6NO2-自由基清除能力的測定在酸性條件下，亞硝酸鹽NO-2能和對氨基苯磺酸發(fā)生反應(yīng)，再與鹽酸萘乙二胺反應(yīng)生成紫紅色絡(luò)合物，在538nm波長處有最大吸收，因此，可通過檢測其吸光度，間接測定NO-2的量。參照鹽酸萘乙二胺法反應(yīng)原理[11]，在538nm處檢測青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物清除亞硝酸鹽的能力。清除率的計算公式如：亞硝酸鹽清除率（%）=[（A0-Ai）/A0]×100，式中：A0為空白對照的OD值，Ai為加有樣品或陽性對照后的OD值。

1.3統(tǒng)計分析采用Excel 2019和DPS 7.05 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，最小顯著差數(shù)法（LSD）進行單因素方差分析。不同小寫字母表示差異性顯著（P<0.05），不同大寫字母表示差異性極顯著（P<0.01）。

2結(jié)果與分析

2.1青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用通過DPPH自由基清除試驗發(fā)現(xiàn)，有35株真菌發(fā)酵液清除率高于50%（見表1），占總供試菌株的25%。其中清除率低于60%高于50%的菌株有10株，編號894F和851F的清除能力最低，均為50.12%;清除率低于70%高于60%的菌株有17株，大于70 %共8株，清除率介于70%～80%之間的菌株有7株，編號分別為913J、885J、892J、909F、882F、937F、820F;清除率高于80%菌株僅1株，編號為937J，為81.32%，131株內(nèi)生真菌清除DPPH能力均小于VC的清除率85.90%。

2.2青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對·OH-自由基清除作用共有103株真菌的·OH-清除能力大于50%，占總供試菌株的77%（見表2）。其中清除率在50%至60%的菌株有17株，編號為903J清除率最低，為50.00%;清除率介于60%～70%、70%～80%之間的菌株分別有25株、29株;清除率高于80%低于90%的菌株有32株，其中，共有7株清除率高于陽性對照VC清除率85.83%，編號為824F、894F、907F、885F、890F、912F、876F;菌株912F和876F的清除能力最強，清除率分別為 87.83%、87.74%。

2.3青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對Fe2+螯合能力共計88株內(nèi)生真菌的Fe2+螯合能力高于50%，占總供試菌的67%（見表3）。清除率大于50%小于60%的菌株有38株，編號930F清除能力最低，為50.14%;清除率在60%至70%之間的菌株36株，清除率高于70%低于80%的菌株有12株，編號為911F、926F、851F、929F、808F、820F、810F、850F、845F、823F、912F、898F;清除率高于80%共有2株，編號為907F、840F，清除率均為82.24%，均低于陽性對照EDTA-2Na清除率85.07%。

2.4青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對O-2·自由基清除作用18株內(nèi)生真菌對清除O-2·能力普遍較弱，只有2株真菌發(fā)酵液的清除率接近于50%。菌株886F的清除率為49.70%，而陽性對照VC清除O-2·能力為96.42%，約為菌株886F的1.9倍。菌株909F的清除率為47.92%，遠低于陽性對照VC的96.42%。

2.5青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對NO-2自由基清除作用18株內(nèi)生真菌中對NO-2·清除率均低于50%，其中編號863F清除率最好，為43.50%，而陽性對照VC清除率為85.20%，約是菌株863F的1.9倍。

3討論

內(nèi)生真菌的生物活性取決于其代謝產(chǎn)物所含的功能性成分。文獻研究表明，目前國內(nèi)外對青錢柳內(nèi)生真菌抗氧化和抗菌活性方面的研究報道較少，僅有寇曉琳等[12]對青錢柳內(nèi)生真菌的抗菌活性進行研究，研究結(jié)果從67株內(nèi)生真菌中篩選出7株菌株具有穩(wěn)定產(chǎn)生黃酮類化合物的能力，進一步的抗菌實驗發(fā)現(xiàn)其中具有較強的抑菌活性作用。相近屬種的其他植物如野核桃[13]和核桃[14]則開展了內(nèi)生真菌的抗菌和抗氧活性的研究。可見，胡桃科植物內(nèi)生真菌蘊藏有抗菌、抗氧化等多種代謝活性物質(zhì)，這同植物與宿主的“共生理論”達成一致，也說明胡桃科植物內(nèi)生真菌是尋找高抗氧化活性物質(zhì)的可選資源。

本研究首次對我國廣西野生青錢柳植物內(nèi)生真菌的抗氧化活性進行篩選研究，發(fā)現(xiàn)了其中蘊藏著豐富的抗氧化活性菌株，其中以菌株909F和886F的抗氧化活性較好，對5種檢測指標均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。本研究結(jié)果還顯示，青錢柳內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物清除·OH-效果最好，次之為Fe2+螯合能力和清除DPPH·能力，而18株菌株清除O-2·、NO-2能力普遍較弱，清除率均小于50%。由此可見，青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵液具有良好的清除自由基能力，一些菌株清除自由基能力較突出，這為從青錢柳中尋找新型天然抗氧化劑提供了寶貴的候選菌種資源。但是，有關(guān)于這些活性菌株的分類地位和抗氧化活性成分的提取分離、鑒定，還有待進一步的深入研究。參考文獻

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基金項目：國家自然科學基金項目（31860128）;中藥學廣西一流學科（桂教科研〔2018〕12號）;廣西中醫(yī)藥大學大學生科研訓練課題（2018DXS15）;廣西高校科技創(chuàng)新和服務(wù)能力提升工程項目-“廣西中醫(yī)藥科技成果轉(zhuǎn)化與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心”（05020058）;廣西中醫(yī)藥大學“岐黃工程”高層次人才團隊培育項目（2018002）。

作者簡介：胡世一（1998-），男，漢族，本科，研究方向為藥用植物內(nèi)生真菌抗氧化活性研究。E-mail：2916268176@qq.com

通信作者：譚小明（1979-），男，漢族，博士，研究員，研究方向為珍稀藥用植物和藥用真菌資源研究。E-mail：txm1978@126.com;周雅琴（1979-），女，漢族，本科，副主任藥師，研究方向為藥用植物內(nèi)生真菌活性成分研究。E-mail：zhouyaqin2009@126.com