共軛亞油酸甘油酯及其微囊乳液對高脂飲食誘導的大鼠非酒精性脂肪肝的緩解作用

文瑾，范超，夏儷寧，石超，吳文忠

(大連醫諾生物股份有限公司，遼寧 大連，116600)

隨著社會的發展進步，生活水平的逐漸提高，很多人飲食結構逐漸失衡，引起了多種代謝綜合征全球化的流行，如脂肪性肝病、Ⅱ型糖尿病、心血管系統疾病、骨關節疾病等。其中，脂肪性肝病已取代慢性乙型肝炎成為我國最常見慢性肝病，發病率不斷攀高并趨于低齡化，因此引起了廣泛的關注[1]。脂肪性肝病可分為酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease, AFLD)與非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease NAFLD)，其中NAFLD患者大多伴有肥胖、胰島素抵抗或2型糖尿病、血脂異常、高甘油三酸酯血癥和高血壓等多種危險因素，引起代謝綜合征高發病率，因此對NAFLD病理機制及治療方法的研究成為了近年來的研究熱點[2-3]。但目前NAFLD的治療主要以祛除誘因、調整飲食、減輕體重為主，尚沒有明確真正有效的治療藥物上市。

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是一種天然的具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸異構體的新型功能性脂肪酸，普遍存在于人和動物體內，但又無法自主合成，僅能從食物中攝取。主要通過攝入反芻動物的脂肪以及牛奶制品而得，其有免疫調節、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗過敏、抗糖尿病、降血脂、影響骨形成等多方面生物學功能[4]。但CLA天然來源較少，且以游離脂肪酸形式存在，易氧化且口感不好，因此人工合成將其制備為甘油酯形式成為了獲取CLA的主要途徑，酯化后保持了CLA的營養價值并且氣味、穩定性更好，且合成成本較低。但由于共軛亞油酸甘油酯(conjugated linoleic acid glyceride, CLA-TG)為含有共軛雙鍵的長鏈脂肪酸酯，因此乳化難度較大。本課題組在前期工作中將CLA-TG與淀粉或膠質、小分子填充物、抗氧化劑在一定條件下有效結合，經剪切乳化及高壓均質制備得到微囊化CLA-TG，使其易于乳化，達到提高穩定性及生物利用度作用[5]。

因此，本研究考察了CLA-TG及微囊化CLA-TG對高脂飲食誘導的NAFLD相關指標的影響，為臨床治療及預防脂肪性肝病提供了一種新的策略，也為CLA-TG的應用開拓了新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共軛亞油酸甘油酯，含量81.4% (c9，t11 CLA 39.6%；t10，c12 CLA 39.6%)(批號11825F)、微囊化共軛亞油酸甘油酯乳液，含上述共軛亞油酸甘油酯20%(批號SNT18103102)，大連醫諾生物股份有限公司；健康成年雄性SPF級SD大鼠，體重160～180 g，共40只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(許可證號：SCXK(京)2016—0006，實驗動物質量合格證編號：No.1100111911028450)。

基礎飼料和高脂模型飼料均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。其中基礎飼料能量配比為64.5%碳水化合物，13.3%脂肪，22.2%蛋白質；高脂飼料能量配比為71%脂肪，11%碳水化合物及18%蛋白質[6]。

甘油三酯、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

電子分析天平，上海第二天平儀器廠；恒溫水浴鍋，上海醫用恒溫設備廠；SCP7OH 低溫超速離心機，美國 HITACHI 有限公司；組織勻漿機，德國 IKA 集團；Thermo 354 酶標儀，美國Thermo Scientific 公司；YS2倒置生物顯微鏡，日本尼康公司；4715 組織包埋機，日本櫻花公司；冰凍切片機，德國徠卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模方法及樣品留存

SD大鼠飼養于SPF級動物房中，單籠飼養，食水自由攝入，動物房溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。將SD大鼠隨機分成4組，每組10只，分別為空白對照組、NAFLD組、CLA-TG組及微囊化CLA-TG組。CLA-TG推薦的人體攝入限量為每日4.5 g/60 kg·BW(成人)，根據人-鼠體表面積折算給藥劑量，將CLA-TG及微囊化CLA-TG分別分散于0.2%羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na)溶液中，二者劑量按攝入CLA-TG含量為0.375 g/kg配制。為排除灌胃操作及溶劑帶來的干擾，將0.2% CMC-Na灌胃處理作為陰性對照。各劑量組均按5 mL/kg·BW給予灌胃。各組處理方式如下：空白對照組：基礎飼料+0.2% CMC-Na灌胃；NAFLD組：高脂飼料+0.2% CMC-Na灌胃；CLA-TG組：高脂飼料+CLA-TG灌胃；CLA-TG微囊組：高脂飼料+微囊化CLA-TG灌胃。各組大鼠自由飲食。實驗時間為6周，實驗期間記錄攝食量，并將血清生化指標及肝臟切片油紅O染色結果作為造模成功的觀測指標。試驗結束后，記錄體重，1%戊巴比妥鈉[0.5 mL/(100 g·BW)]麻醉，腹主動脈取血5 mL并處死動物。血樣留存分析，取肝臟洗凈，取少量置于4%多聚甲醛固定，室溫靜置24 h，切片用于肝臟組織病理學研究，其余部分液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中留存備用[7]。

1.3.2 生化指標檢測

腹主動脈取血后，將血樣在室溫下自然凝固20 min，然后在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，離心后收集血清[8]。將大鼠肝臟組織在冰冷的生理鹽水中勻漿，然后將勻漿物以3 500 r/min 在4 ℃下離心20 min。收集大鼠肝勻漿的上清液部分。制得10%的組織勻漿，血清與組織勻漿置于-80 ℃冰箱中保存待測。根據試劑盒的使用說明書測定大鼠血清或組織勻漿液中的谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)及甘油三酯(triglyceride，TG)含量[9]。

1.3.3 病理學檢測

將多聚甲醛中固定的肝臟組織進行冰凍切片制備并用油紅O染料染色。冰凍切片機切取15 μm的冰凍組織，將組織裱貼于載玻片，經油紅O常規染色方法染色，隨機選擇樣品在光學顯微鏡下觀察并采集圖像。肝細胞脂肪變的范圍通過半定量進行評估。根據肝組織的腺泡結構測算脂肪變的肝細胞百分比：5%～33%為輕度脂肪變，34%～66%為中度脂肪變，>66%為重度脂肪變[10-11]。

1.4 數據處理與分析

實驗中涉及的所有值均表示為mean±SD。數據間的比較使用單因素方差分析(ANOVA)，然后進行student-newman-keuls(SNK)檢驗。本實驗的所有實驗結果代表至少3次獨立實驗。使用GraphPad Prism5.0(GraphPad Prism Software，La Jolla，CA)進行統計學分析。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 微囊化CLA-TG對NAFLD大鼠體重、體重增重、脂體比的影響

在高脂飲食誘導的NAFLD發展過程中，多伴隨著肥胖的發生[12]。首先檢測了該NAFLD模型是否引起肥胖。在整個實驗周期內各組大鼠皮毛光澤度好，正常進食飲水，活動自如，對外界刺激反應迅速，無腹瀉及死亡現象且均未出現異常行為。結果如表1所示，在第6周末，與空白組相比，NAFLD組大鼠的末期體重、體重增重、脂體比顯著升高(P<0.01)，分別升高13.7%、61.5%、42.7%，該結果與長期高脂飲食易導致肥胖發生的認知一致；CLA-TG組與NAFLD組對比，末期體重、體重增重及脂體比有了明顯下降(P<0.05)，分別下降了7.0%、25.1%、14.8%，且微囊化CLA-TG組大鼠有更好的減重、減脂效果，與NAFLD組相比，分別下降了9.3%、30.7%、17.0%。且在整個實驗周期內，各組大鼠攝食量并沒有明顯差異(圖1)。從以上結果可知，CLA-TG及微囊化CLA-TG能夠在不影響攝食量的前提下緩解NAFLD引起的肥胖。

表1 CLA-TG及微囊化CLA-TG對大鼠體重、體重增重、脂體比的影響Table 1 Effect of CLA-TG and microencapsulated CLA-TG on the body weight, weight gain and fat-to-body ratio in rats

圖1 CLA-TG及微囊化CLA-TG對大鼠總攝食量的 影響(n=10)Fig.1 Effect of CLA-TG and microencapsulated CLA-TG on the food intake in rats

2.2 微囊化CLA-TG對NAFLD大鼠血脂水平的影響

脂代謝紊亂是NAFLD患者的病理現象之一,主要表現為血脂的異常升高[6]。因此檢測了大鼠血清血脂含量，如圖2所示，NAFLD組大鼠與空白對照組相比LDL-C、TC、TG水平顯著升高，分別從(0.357±0.07)、(1.45±0.11)、(0.71±0.33)mmol/L上升為(0.52±0.11)、(2.20±0.19)、(2.09±0.43)mmol/L，分別升高了45.7%、51.7%、194.4%，HDL-C水平顯著下降(P<0.01)，從(0.58±0.08)mmol/L降低至(0.50±0.05)mmol/L，下降13.8%。

a-HDL-C；b-LDL-C；c-TC；d-TG圖2 CLA-TG及微囊化CLA-TG對大鼠血清血脂水平的影響(n=10)Fig.2 Effect of CLA-TG and microencapsulated CLA-TG on the serum blood lipids levels in rats注：**與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.01)；*與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05)；#與NAFLD組相比有顯著性差異(P<0.05)(下同)

結果證明，在本研究中NAFLD模型大鼠血脂水平顯著升高。CLA-TG組能夠顯著下調血清中LDL-C、TC、TG水平及上調HDL-C水平(P<0.05)，分別為(0.43±0.08)、(1.88±0.19)、(0.95±0.45)、(0.58±0.04)mmol/L，分別下(上)調17.3%、14.5%、54.5%、13.8%，且CLA-TG微囊化處理后降血脂作用有所增強，LDL-C、TC、TG水平下調至(0.39±0.08)、(1.68±0.14)、(0.82±0.36)mmol/L，分別下調了25%、23.6%、60.8%，HDL-C水平上調至(0.62±0.08)mmol/L，上調24.0%。上述結果證明CLA-TG及微囊化CLA-TG的攝入能夠緩解NAFLD引起的高血脂。

2.3 微囊化CLA-TG對NAFLD大鼠的血液生化指標的影響

血液中的ALT及AST是反映肝臟損傷的重要且敏感的生化指標[13]。因此，檢測了血清中的ALT、AST含量以考察本實驗中的大鼠肝損傷情況。如圖3所示，NAFLD組大鼠ALT、AST與空白對照組相比有顯著上升(P<0.001)，分別從(33.90±12.03)、(18.40±9.22)U/L上升至(79.00±9.77)、(87.00±24.59)U/L，分別上133.0%、372.8%，提示本研究NAFLD模型引起了嚴重肝損傷。CLA-TG組能夠顯著下調血清中ALT、AST含量(P<0.05)，分別下調至(59.10±20.56)、(61.44±20.11)U/L，下調比列分別為25.2%、29.4%，且微囊化CLA-TG組較CLA-TG組對以上血清學指標下調稍多，分別下調至(55.30±20.95)、(62.22±18.24)U/L，下調比例為30%、28.5%，證明CLA-TG及微囊化CLA-TG的攝入能夠緩解NAFLD引起的肝損傷，且CLA-TG微囊化處理后效果優于CLA-TG。

2.4 微囊化CLA-TG對NAFLD大鼠的肝臟TG含量的影響

NAFLD疾病發展的起點為肝臟TG的累積[14]。為了進一步探究CLA-TG對NAFLD大鼠的肝脂肪變性情況，對肝臟中TG的累積進行了考察。實驗結果如圖4所示，NAFLD大鼠肝臟TG水平與基礎飼料飼養組相比有顯著上升(P<0.001)，從(3.06±1.17)mmol/L上升至(5.23±1.16)mmol/L，增加了70.9%，在CLA-TG組及微囊化CLA-TG組中肝臟TG含量顯著下調(P<0.05)，分別下調至(3.99±0.80)、(3.79±0.95)mmol/L，下調比例分別為23.7%、27.5%，證明CLA-TG及微囊化CLA-TG的攝入能夠降低NAFLD大鼠肝臟中TG累積，即證明CLA-TG及微囊化CLA-TG的攝入可能對NAFLD大鼠的肝脂肪變性具有一定的緩解作用。

a-ALT；b-AST圖3 CLA-TG及微囊化CLA-TG對大鼠血清ALT、AST 水平的影響(n=10)Fig.3 Effect of CLA-TG and microencapsulated CLA-TG on the serum ALT and AST levels in rats

圖4 CLA-TG及微囊化CLA-TG對大鼠肝臟TG 水平的影響(n=10)Fig.4 Effect of CLA-TG and microencapsulated CLA-TG on the liver TG levels in rats注：***與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.001)

2.5 微囊化CLA-TG對NAFLD大鼠肝臟脂滴積聚的影響

NAFLD的病變主要在肝小葉以肝細胞脂肪變性和脂肪貯積為主要病理特征[15]。因此采用油紅O染色技術對肝臟切片進行脂滴染色，直觀考察肝臟脂肪沉積情況[11]。如圖5所示，與空白對照大鼠相比，NAFLD大鼠肝臟細胞中出現大量的脂滴積聚現象(P<0.01)，油紅O染色評分從(2.3±1.1)上升為(4.2±0.98)，但在CLA-TG組并未顯著緩解脂滴積聚現象，但在微囊化CLA-TG組，肝臟細胞中脂滴堆積情況有一定減輕(P<0.05)，油紅O染色評分降低為(2.7±1.1)，證明CLA-TG微囊化后能夠進一步減輕NAFLD大鼠肝細胞中脂滴堆積現象。

3 討論與結論

NAFLD作為全球范圍內發病率最高的一種肝臟代謝類疾病，發病機制復雜，迄今為止尚未完全闡明。目前在臨床上，多選擇對機體脂代謝具有調節作用的藥物應用于NAFLD的治療。其中，一些具有減輕體重或調節新陳代謝作用的功能性食品可能對于NAFLD的治療起到重要作用。

CLA是亞油酸的一類同分異構體，常以c9t11和t10c12-CLA異構體形式存在，也是多種CLA異構體中具有生理活性的成分。研究報道，CLA具有減肥、降血糖、免疫調節、抗癌、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗過敏、改善骨質疏松等多方面生物學功能，目前廣泛應用于減肥產品中[4, 16]。在NAFLD的發病機制中，較經典的理論為“二次打擊”學說，該學說認為，機體首先產生胰島素抵抗，抑制脂質過氧化，使肝內脂肪酸利用減少，導致肝脂肪變，包括肝臟過多脂肪積聚、脂代謝紊亂，使肝對外界刺激敏感性增加，形成“初次打擊”。各種致病因素引發的氧化應激使反應性氧化物和脂質過氧化物增多，進而引起細胞炎性因子釋放增加，促進肝細胞發展為炎癥和病變壞死，形成“二次打擊”[17]。研究報道，CLA具有抑制脂肪酸合成酶活性及胰島素增敏作用，可通過改善線粒體功能，上調脂肪動員和分解相關酶的表達，影響脂肪酸的攝取和氧化及脂質的合成代謝，從而發揮減肥、降脂、降糖、改變脂肪酸組成等作用[18]。且CLA還可以緩解短期高果糖飲食誘導的NAFLD中肝臟擴大及肝糖原累積，改變肝內脂肪酸組成，下調新生脂肪合成基因的表達并改善血管內皮功能障礙[19]。因此，CLA在高脂飲食誘導的NAFLD的治療中可能具有較好的應用前景，其作用機制可能與增加肝臟對胰島素的敏感性、促進肝脂肪代謝、減少肝內脂肪合成、增強肝臟抗氧化能力有關。

但CLA在實際應用中，由于游離脂肪酸形式易氧化，性質不穩定、氣味不好聞，因此常將其進行結構改造以提高其應用性。其中，CLA-TG是CLA的主要酯化形式，在保持CLA生理功能和營養功能的同時，增加脂溶性，具有穩定性更好、氣味更平和、更易被吸收等優點，還可防止體內脂質累積[20]。目前CLA-TG屬于新資源食品，可從紅花籽油中提取，合成成本低，營養價值高。由于功能性脂肪酸特殊的分子結構，使其容易氧化、酸敗，為了有效保護CLA-TG，避免遭受外界環境的破壞，同時也為了改變物質形態，提高應用性，使脂溶性的CLA-TG具有冷水分散性質，開發了CLA-TG的微囊乳液。微囊系指利用天然的或合成的高分子材料(統稱為囊材)作為囊膜壁殼，將固態或液態活性成分包裹成的藥庫型微型膠囊，常以溶液、分散體或乳液的形式使用[21]。近年來，大量研究表明活性成分制成微囊后主要可以增加其穩定性，提高溶解度，掩蓋不良臭味，防止在胃內破壞或對胃的刺激作用，延長作用時間達到緩釋效果，提高生物利用度等[22-23]。基于上述理論基礎，本研究在驗證CLA-TG抗NAFLD功效基礎上，進一步探究CLA-TG微囊化乳液通過提高生物利用度從而提升其療效。

在肥胖群體中，NAFLD的患病率高于一般人群(25%～30%)[24]。大量研究證明，NAFLD與肥胖之間可能存在雙向調節作用，即肥胖影響NAFLD的發生發展，NAFLD也可能通過多種機制加重肥胖，如引起肝功能障礙，肝缺血再灌注，氧化應激，加重糖毒性和脂毒性等[12, 25]。在本實驗中，高脂飲食誘導的NAFLD大鼠體質量、體重增重增加，即誘發產生肥胖。同時引起血脂代謝紊亂，表現為血液中TC、TG及LDL含量顯著上調，HDL含量顯著下降。在給予CLA-TG及微囊化CLA-TG處理后，在顯著減輕NAFLD大鼠體重基礎上，進一步降低了血液中上調的TC、TG及LDL水平，升高了HDL，減輕高血脂癥狀。因此，本實驗驗證了CLA-TG或微囊化CLA-TG的攝入對NAFLD大鼠的肥胖現象可起到調節作用，且CLA-TG微囊化后對體重及血脂的調節作用進一步提升。

除肥胖外，在NAFLD患者中大多存在5%～10%的肝脂肪變性[26]。其原因在于NAFLD患者的脂肪細胞存在功能障礙和胰島素抵抗，導致脂解作用加速和皮下脂肪組織中脂肪酸吸收減少，引起循環中產生過量的游離脂肪酸，形成異位脂肪積聚(如肝臟、骨骼肌等)，產生脂毒性[25]。在該條件下，肝細胞則發揮脂肪細胞樣功能的作用，但肝細胞缺乏處理過量游離脂肪酸的能力，因此過量的脂質則以TG的形式存儲在肝細胞中，導致肝脂肪變性。TG在肝臟中衍生的有毒代謝產物異位積累，激活肝內炎癥反應，引起細胞功能障礙，導致肝細胞脂凋亡，最終形成非酒精性脂肪肝炎[27-29]。因此，肝脂肪變性的發生被廣泛認定為NAFLD病程的起點，最終導致了可逆或不可逆性肝損傷。在本研究中，首先通過檢測血清轉氨酶含量來考察肝損傷情況，高脂飲食誘導的NAFLD大鼠模型表現出了顯著的ALT、AST上調，即嚴重的肝損傷，而CLA-TG及微囊化CLA-TG干預后，大鼠 ALT、AST水平降低，說明在本研究所述NAFLD中，CLA-TG具有修復肝損傷、改善肝功能的作用。進一步通過對肝臟組織中TG含量的檢測，發現在高脂飲食誘導的NAFLD模型中，出現了顯著的肝臟TG累積，而CLA-TG及微囊化CLA-TG的攝入顯著降低模型組中的TG累積。根據對肝臟組織切片進行油紅O染色，直觀地對肝臟脂滴觀察，結果表明微囊化CLA-TG能抑制NAFLD大鼠肝臟中的脂滴積聚，該現象可能與CLA-TG微囊化后可通過促進其吸收，提高生物利用度有關。綜上所述，CLA-TG能夠緩解NAFLD引起的肝臟損傷，且CLA-TG微囊化后可能具有更好的緩解作用。

綜上所述，本研究所得結論如下：CLA-TG或微囊化CLA-TG能夠在不影響攝食量的前提下降低高脂飲食誘導的NAFLD大鼠的體重，降低血脂，同時減輕高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝損傷。還驗證了微囊化的CLA-TG可能具有更好的緩解作用。但仍需要進一步探尋CLA-TG對NAFLD緩解功效的作用機制。總而言之，本研究提供CLA-TG在減肥及緩解高脂飲食引起的脂肪肝方面的應用，并驗證了CLA-TG微囊化后作用有較明顯的增強，為開發安全有效的減肥產品及治療脂肪肝的食品、保健品及藥品提供數據支持。