米漿發酵過程中的微生物群落變化

謝玲，蘭林，李宇航，錢葉遷，石崇勇，袁平，任元元，李玉鋒*

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，611730)2(樂山闕記食品有限公司，四川 樂山，614000) 3(四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都，611130)

大米，是稻谷經過清理、礱谷、碾米、成品整理等工序后制成的成品[1]。當今世界的大米加工工藝已經比較成熟[2]，制品的品質是關系消費者需求的主要因素，目前已將研究重點轉移至稻米的深加工和綜合利用上。為滿足消費者對食品提出的安全、營養、保健的等方面的要求，需不斷開發新的大米產品[3]。大米經過清洗、浸泡、磨漿、發酵等工序后，可加工成大米乳酸飲料、米發糕、米酒等制品。米漿發酵作為中國傳統米制品加工的重要工序，經過此加工過程，微生物群落組成復雜多樣，且易滋生雜菌，導致發酵不易控制，從而出現質量問題及安全隱患[4]。現有研究多集中在發酵米制品的加工工藝及食味品質，對米漿發酵過程中微生物群落變化的研究較少。研究米漿發酵體系的微生物群落結構對改善發酵米制品品質及風味具有重要的作用[5]。

高通量測序是20世紀70年代由FREDERICK發明的雙脫氧鏈終止法核酸測序技術。近年來被廣泛應用于食醋、白酒、泡菜、豆豉等發酵過程中微生物群落的測定[6-7]，該技術能快速、準確地對發酵食品的微生物組成及其豐度變化進行多方位的研究，在食品微生物快速檢測中有著重要的應用前景[8-9]。本研究基于高通量測序技術，探究傳統自然發酵過程中不同發酵階段的微生物生長變化規律，為后續復合菌劑的制備和米制品質量控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新米漿、老漿，樂山闕記食品有限公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒(Q10212)，Life；E.A.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(M5635-02)，美國OMEGA公司；2×Hieff? Robust PCR Master Mix(10105ES03)、Hieff NGSTMDNA Selection Beads(2601ES56)，翌圣(Yeasen)生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機，Thermo Fisher；GL-88B旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器，深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽，北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統，上海復日科技有限公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計，Invitrogen；ETC 811 PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司；Research plus 0.5～10 μL移液器，Eppendorf。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

參照傳統自然發酵法，將100 g新米漿中接入10 g老漿[m(老漿)∶m(新米漿)=1∶10]，密封后在16～20 ℃發酵40 h，分別在0、8、16、24、32、40 h取樣10 g，并將細菌分別標號為(A0-bac)～(A5-bac)，真菌分別標號為(A0-fun)～(A5-fun)。

參照文獻[10-11]的方法，將每個時間點的米漿樣品各取5 g，加入20 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(0.137 mol/L NaCl，0.002 7 mol/L KCl，0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，pH 7.0)懸浮，并加入0.5 g玻璃珠后充分渦旋5 min。在4 ℃離心機中2 000 r/min離心5 min，收集上清液。將沉淀用PBS洗滌2次并收集上清液。將所有上清液于4 ℃，10 000 r/min離心10 min棄去上清液，收集沉淀。收集的沉淀用1 mL的PBS重懸，轉入1.5 mL的EP管中，-20 ℃凍存備用。

1.3.2 總DNA提取

參考李榮源等[10]的方法，對樣品進行處理后，使用DNA抽提試劑盒(OMEGA，美國)進行DNA提取，步驟嚴格參照DNA抽提試劑盒說明書，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量。

1.3.3 PCR擴增及高通量測序

參考高乾坤等[12]的方法，以檢驗合格的細菌基因組為模板，引物針對16S rRNA基因V3/V4區合成特異引物，Nobar_341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)，Nobar_805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)。以提取的總真菌的基因組為模板，引物針對16S rRNA基因ITS1-ITS2區合成特異引物，ITS1:(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)，ITS2：(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。根據PCR擴增產物濃度進行等濃度混樣，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測效果。將合格的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4 數據處理

利用Usearch軟件將最終優化數據在97%相似度水平下進行運算分類單位(operational taxonomic unit,OTU)聚類分析；基于OTU聚類分析結果，利用Mothur軟件對α多樣性指數進行分析；基于分類學信息，利用統計學方法對各分類水平進行群落結構的統計分析；利用方差分解將數據差異反映在二維坐標上繪制主成分分析圖。作圖軟件使用R軟件和origin 8.0。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 細菌多樣性分析

2.1.1 細菌OTU聚類分析

為研究各樣本間的微生物組成，以97%的相似度水平對所有樣本的有效序列進行OTUs聚類分析并進行物種注釋。16S rRNA的V4區間經過濾和雙端拼接后共得到383 814條有效序列，聚類得到447個OTU。Venn圖可以顯示所有樣本共有OTU和特有OTU的數目，為直觀顯示樣品OTU組成數目的相似性及重疊性，對米漿發酵過程各時間點的細菌的OTU進行統計，結果如圖1所示。米漿整個發酵過程中細菌共有的OTU數為16個。發酵初期樣品中特有OTU數為15個，隨著發酵時間的延長，在32 h時特有OTU數目為1個，其他時間點均為0個，證明在環境中獲得的細菌數量少。將每個OTU與細菌分類學數據庫對比后得到其物種注釋，共2個門，8個屬水平的細菌。結果表明，自然發酵過程與老漿細菌種類相似，證明發酵過程感染的細菌量少，與孟燕華[13]的研究結果一致。

圖1 不同發酵階段細菌OTU數Fig.1 Number of bacterial OTU in different stages of fermentation

2.1.2 細菌α多樣性分析

α多樣性分析能反映微生物群落的豐度和多樣性，利用統計學分析指數(P<0.05)估計群落的物種豐度和多樣性。Chao指數體現群落豐度，其值越大表明群落豐富度越大。OTUs體現物種的豐富度，ACE指數用于估計群落中OTU數目的指數。Shannon和Simpson指數都能體現群落多樣性，Shannon值越大，Simpson值越小，群落多樣性越高。Shannoneven是反映物種個體數目在群落中分配的均勻程度的指數。由表1可知，在整個發酵過程中，OTUs、Chao和Ace指數在0～16 h時增加，然后減少至32 h后再增加，物種豐富度和多樣性在16 h最高，32 h最低。覆蓋率均在99.94%～99.99%，證明樣本中的細菌幾乎都被檢測到，該數據可靠。

表1 樣品中細菌α多樣性指數測定結果Table 1 α-Diversity of bacteria in samples

2.1.3 細菌物種組成分析

2.1.3.1 門水平米漿發酵過程群落結構分析

米漿發酵體系中共檢測出2個門的細菌(圖2)，在發酵初期厚壁菌門(Firmicutes)占全部細菌群落的89.22%，螺旋菌門(Spirochaetota)占10.33%，其他物種占0.46%。隨著發酵時間的延長，厚壁菌門的豐度增加至99.40%，螺旋菌門的豐度降低至0.05%。5組樣品中厚壁菌門的豐度均最高，可見厚壁菌門是米漿發酵體系的優勢微生物。厚壁菌門是半固態發酵食品中的重要微生物，如乳制品、酒類、醬油等[14],這與本研究結果一致。

圖2 門水平細菌相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria at phylum level

2.1.3.2 屬水平米漿發酵過程群落結構分析

米漿發酵體系共檢測出8個屬的細菌，其他物種合并為Other(圖3)。由圖3可知，屬水平上發酵體系的細菌主要有乳桿菌屬，短螺旋體屬(Brachyspira)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和需鹽芽孢桿菌屬(Virgibacillus)。發酵初期，乳桿菌屬的相對豐度為84.46%，短螺旋體屬的豐度為10.33%，芽孢桿菌屬的豐度為5.05%。隨著發酵時間的延長，乳桿菌屬的豐度逐漸增加至97.09%，短螺旋體屬的豐度逐漸降低至0.02%，芽孢桿菌屬的豐度逐漸降低至0.59%。芽孢桿菌是廣泛存在于環境中的腐生菌，多屬于需氧或兼性厭氧菌。楊磊等[15]在濃香型酒醅中分離得到1株地衣芽孢桿菌。鄧岳等[16]發現在傳統工藝釀造的醬油中分離得到的芽孢桿菌是酸類、酮類、含硫類、吡嗪類等低閾值化合物合成的重要微生物。大多數乳酸菌能在低氧發酵過程中利用糖類產生乳酸結合乙醇后形成乳酸乙酯，可為發酵體系提供特殊的風味物質并降低發酵體系的pH值，所產生的乳酸菌素能抑制雜菌生長。故乳酸菌在保證產品風味和品質方面起著極其重要的作用，這與李美倫等[17]的研究結果一致。

圖3 屬水平細菌相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria at the genus level

2.1.3.3 屬水平米漿發酵過程微生物群落主成分分析

主成分分析可找出數據中最主要的元素和結構。X軸和Y軸代表選定的主成分軸，圖中不同顏色的點代表不同樣本來源，各點間的距離代表相似程度，越近相似度越高。由圖4可知，各樣本間有明顯差異。A0-bac在坐標軸左側上方且與其他5個樣本的距離較遠，表明剛接入老漿時細菌多樣性與后續發酵過程差異較大。A1-bac至A5-bac這5個樣品均在坐標軸右側且距離相對較近，表明環境中的細菌變化較小，這與高赟[18]的研究結果相似。

圖4 屬水平細菌主成分分析Fig.4 PCA of bacteria at genus level

2.2 真菌多樣性分析

2.2.1 真菌OTU聚類分析

真菌的ITS1經過濾和雙端拼接后共得到433 198條有效序列，聚類得到870個OTU。對米漿發酵過程各時間點的細菌OTU進行統計，結果如圖5所示。真菌的共有OTU數目37個。發酵初期特有OTU數為27個，在第8 h減少至8個，在第16 h又增加至13個，發酵終點時特有OTU數為8個。證明從環境中獲得一定數量的真菌。將每個OTU與細菌分類學數據庫對比后得到其物種注釋，共2個門，9個屬水平的真菌。結果表明，在整個發酵過程中，由于乳酸菌產酸導致部分真菌不適應低pH環境，故生長被抑制，這與文獻[19-20]的研究結果一致。

2.2.2 真菌α多樣性分

真菌α多樣性如表2所示。在米漿發酵全過程40 h中，OTUs、Chao和Ace指數在發酵初期開始增加至第8 h，然后降低并在發酵后期略有升高。Shannon和Simpson指數分別在40 h時達到最大和最小，說明在發酵終點真菌多樣性最高，即此時真菌豐度最高，這與古明亮等[21]的研究結果一致。

圖5 不同發酵階段真菌OTU數Fig.5 Number of fungal OTU in different stages of fermentation

表2 樣品真菌α多樣性指數測定結果Table 2 α-Diversity of fungal in samples

2.2.3 真菌物種組成分析

2.2.3.1 門水平米漿發酵過程群落結構分析

米漿發酵體系中共檢測出2個門的真菌，分別為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。子囊菌門在發酵體系占主導地位，在發酵初期其相對豐度占真菌群落的98.48%，隨著發酵時間的延長其含量幾乎無變化，證明其在發酵過程中起重要的作用，為體系的主要優勢菌。擔子菌門的豐度在整個發酵過程中都低于1.5%，作為真菌中最高等的門類，多數為大型真菌，故在米漿發酵體系的作用不大且不易生長，此結果與張文齊等[22]的研究結果相似。

圖6 門水平真菌相對豐度Fig.6 Relative abundance of fungi at the phylum level

2.2.3.2 屬水平米漿發酵過程群落結構分析

米漿發酵體系中共檢測出9個屬的真菌。由圖7可知，米漿發酵體系主要有哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania)、雙足囊菌屬(Dipodascus)、釀酒酵母菌屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、木克拉酵母屬(Mrakia)、曲霉屬(Aspergillus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)。哈薩克斯坦酵母屬在發酵初期豐度為73.49%，8 h豐度達到86.86%然后開始減小，至發酵終點豐度為46.87%，為發酵體系的主要優勢菌。哈薩克斯坦酵母屬參與發酵體系乙酸乙酯、β-苯乙醇、異戊醇等香氣物質的產生，并能利用糖類產生乙醇和CO2，使米漿漿體變得多孔蓬松并獲得特殊風味，提升了產品的口感和風味[23]，這與王雪山[24]的研究結果一致。

2.3.3.3 屬水平米漿發酵過程群落主成分分析

由圖8可知，各樣本間有明顯差異。A0-fun在坐標軸左上側且與其他5個樣本距離較遠，表明剛接入老漿時真菌多樣性較大，A3-fun和A4-fun的距離較近，表明在發酵24～32 h時真菌的多樣性達到相對穩定，其多樣性差異不明顯。A1-fun至A5-fun這5個樣品的差異較明顯，表明環境中的真菌變化較大，這與方冠宇[25]的研究結果相似。

圖7 屬水平真菌相對豐度Fig.7 Relative abundance of fungi at genus level

圖8 屬水平真菌主成分分析Fig.8 PCA of fungi at genus level

3 結論

本研究采用高通量測序技術對米漿不同發酵時間微生物多樣性進行分析。研究發現，在門水平上，厚壁菌門和子囊菌門為發酵體系主要優勢菌門。在屬水平上，乳桿菌屬、哈薩克斯坦酵母屬、雙足囊菌屬和釀酒酵母屬為發酵體系主要優勢菌屬，這些優勢菌主要影響著發酵體系特殊風味物質的生成和發酵米制品的品質。高通量測序技術能分析各時間點的微生物組成及豐度變化規律，為發酵米制品的生產提供了一定的理論依據。