不同接種方式對(duì)青梅酒品質(zhì)的影響及微生物多樣性研究

劉英杰，黃鈞，劉建，吳重德，金垚，周榮清

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)

青梅(Prunusmume)，又稱果梅，是藥食同源的水果，含有多種有益的活性組分[1]。青梅酒，具有獨(dú)特的水果和花香，且有益健康[2]，是一種非常受歡迎的酒精飲料,主要有發(fā)酵型和浸泡型，前者在保留了青梅果香的同時(shí)，還貢獻(xiàn)了更豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。TIAN等[3]報(bào)道，發(fā)酵型青梅酒中的氨基酸含量普遍高于浸泡型青梅酒，佐以蔗糖和糯米的發(fā)酵型青梅酒，抗氧化性能更好[4]。以不同種屬的酵母菌共培養(yǎng)發(fā)酵葡萄酒等果酒，是改善其特征風(fēng)味的有效途徑[5-7]。目前，研究人員對(duì)青梅酒這類小眾果酒的微生物多樣性尚缺乏研究，主要是借鑒葡萄酒釀造的相關(guān)技術(shù)[8]。原料自身攜帶的微生物是發(fā)酵劑的主要來源，青梅果實(shí)酸度較高，對(duì)微生物群落及代謝影響顯著。基于葡萄酒酵母發(fā)酵青梅酒不僅乙醇含量低，揮發(fā)性酸含量高，且揮發(fā)性組分特色不突出。應(yīng)用葡萄酒共培養(yǎng)發(fā)酵的非釀酒酵母，如Torulasporadelbrueckii，發(fā)酵果酒，產(chǎn)揮發(fā)酸少且對(duì)SO2抗性高，其代謝產(chǎn)物中的異戊醇、苯乙醇、乙酯類和萜烯類可賦予果酒獨(dú)特風(fēng)味[9-10]。其是否適合青梅發(fā)酵尚待探討，且與Saccharomycescerevisiae共培對(duì)青梅酒發(fā)酵的微生物群落及代謝組分的影響尚未見報(bào)道。

本文主要研究基于S.cerevisiae單培接種與T.delbruecki順序共培養(yǎng)接種及多輪補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)青梅酒主要理化參數(shù)、代謝組分及微生物群落多樣性的影響規(guī)律，解析優(yōu)勢微生物種屬與主要代謝組分的相關(guān)性。旨在揭示釀酒酵母與非釀酒酵母共培養(yǎng)對(duì)青梅酒特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)規(guī)律，奠定過程參數(shù)優(yōu)化的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅，四川省大邑縣；一級(jí)蔗糖，本地副食商店。草酸、檸檬酸、酒石酸、L-蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、辛酸甲酯等標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich公司(上海)；其他化學(xué)藥品，蔚藍(lán)化學(xué)(中國成都)。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備VF-WAX-MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美國Thermo Fisher Electron公司；HPLC配備UV/Vis檢測器和有機(jī)酸柱(Alltech OA-1000，300 mm×6.5 mm×9 μm)，美國Agilent公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；CX31顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

原料經(jīng)挑選、清洗瀝水，以m(果)∶m(糖)=5∶1逐層用蔗糖覆蓋青梅果(4個(gè)50 L發(fā)酵罐)，糖漬約36 h后，蔗糖溶解，分別加入偏重亞硫酸鈉至糖梅汁中SO2的質(zhì)量濃度為120 mg/L，隨后調(diào)節(jié)(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為150 mg/L。接種S.cerevisiae(5×106CFU/mL)到發(fā)酵罐中，樣品編號(hào)為S；接種S.cerevisiae后又接種T.delbrueckiiY7(CCTCC M2019523)的樣品編號(hào)為S+T，其初始濃度均為5×106CFU/mL；未接種發(fā)酵罐(ZR)為對(duì)照。這3個(gè)發(fā)酵罐同時(shí)進(jìn)行周期性攪拌，另取1個(gè)未接種的發(fā)酵罐采用靜置發(fā)酵方式，以更好地模擬自然發(fā)酵，編號(hào)為ZD。接種發(fā)酵的2個(gè)發(fā)酵罐，發(fā)酵至糖的質(zhì)量濃度降至0.4 g/L以下，取出清汁(第1輪原酒)后，補(bǔ)加與殘留青梅果等體積的23°Brix的蔗糖溶液，同樣條件發(fā)酵結(jié)束后，再重復(fù)補(bǔ)加蔗糖溶液發(fā)酵。第2、3輪接種發(fā)酵的原酒標(biāo)注2F和3F。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 理化指標(biāo)的測定

主要理化指標(biāo)(殘?zhí)恰⒖偹帷⒕凭取]發(fā)酸)的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.2 色度和色調(diào)的測定

根據(jù)BIMPILAS等[11]的方法測定青梅酒的色度和色調(diào)，用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度，其中色度=A420+A520+A620，色調(diào)=A420/A520。

1.4.3 抗氧化活性的測定

抗壞血酸含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]測定。多酚含量、DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除活性采用WANG等[13]的方法測定。總抗氧化能力參照總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行分析。

1.4.4 有機(jī)酸的測定

HPLC檢測程序：按參考文獻(xiàn)[14]所述方法，稍作修改。采用Agilent Chemstation軟件對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析，根據(jù)檸檬酸、L-蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間來判定樣品中的有機(jī)酸種類，采用外標(biāo)法定量，應(yīng)用HPLC分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上述有機(jī)酸含量。

操作方法：準(zhǔn)確吸取10.00 mL樣品，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取3 mL上清液加載至經(jīng)甲醇活化的固相萃取(solid phase extraction，SPE)小柱(成都SWELL公司)洗脫，取中間1 mL洗脫液，再用0.22 μm水系濾膜過濾后待HPLC檢測。HPLC檢測條件：流動(dòng)相為9.00 mmol/L的H2SO4溶液，恒定流速為0.60 mL/min，柱溫箱溫度為75 ℃，檢測波長為215 nm。

1.4.5 揮發(fā)性成分的測定

參考ZHENG等[15]所述方法，稍作修改。準(zhǔn)確吸取0.5 mL樣品置于15 mL頂空瓶中，加入2 mL純水，再加入10 μL內(nèi)標(biāo)(79 mg/L辛酸甲酯)和1.5 g NaCl后密封，放入60 ℃水浴中預(yù)熱平衡15 min，然后插入固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDM，美國Supelco公司)萃取吸附40 min，取出插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min后檢測。檢測條件與NIU等[16]所述相同，稍作修改。操作條件：進(jìn)樣口溫度為270 ℃，升溫程序：40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，然后6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。載氣為高純氦，流速為1 mL/min，不分流模式。質(zhì)譜離子源傳輸管的溫度分別是300 ℃和250 ℃；電離方式為EI，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu。

1.4.6 高通量測序

DNA提取、PCR擴(kuò)增按照HE等[17]和TANG等[18]所述的方法進(jìn)行，并稍作修改。按照Fast DNA SPIN提取試劑盒操作說明對(duì)第1輪原酒的微生物進(jìn)行基因組DNA提取，將提取的DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小判斷，取3 μL核酸用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)采用通用引物338F/806R，真菌rRNA基因的ITS1區(qū)分別用通用引物ITS5F/ITS1R進(jìn)行擴(kuò)增。PCR純化產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq基因測序試劑盒v3進(jìn)行2×300 bp雙端測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME(v1.8.0)和R包(v3.2.0)進(jìn)行。原始數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行單因素方差分析，以確定樣本間的差異，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異。采用SIMCA 14.1(瑞典Umetrics公司)軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)。應(yīng)用Canoco 5.0進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。其他統(tǒng)計(jì)分析使用Origin 2018。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 主要理化性質(zhì)及抗氧化活性的差異

如表1所示，主要理化性質(zhì)、色度和色調(diào)等指標(biāo)隨接種方式的不同而變化。與自然發(fā)酵相比，其余原酒，無論是單培接種還是順序共培接種，其殘?zhí)呛烤^低，酒精度較高。由于酸脅迫對(duì)酵母菌的抑制，導(dǎo)致第1輪的S和S+T的酒精度比后兩輪低[19]。同時(shí)，原酒間的總酸和揮發(fā)酸含量具有顯著差異，且單培接種的揮發(fā)酸低于順序共培接種的。后兩輪總酸和揮發(fā)酸以及色度逐輪下降，而色調(diào)先上升后下降。在發(fā)酵周期方面，ZR和ZD需要1個(gè)月左右，而接種強(qiáng)化發(fā)酵每輪僅需7～11 d，在充分利用青梅剩余價(jià)值的同時(shí)，發(fā)酵時(shí)間明顯縮短。

表1 理化指標(biāo)及抗氧化活性的差異Table 1 Difference of physicochemical indexes and antioxidant activities

所有原酒的總抗氧化力較高，ABTS清除率和多酚含量沒有明顯差異，DPPH自由基的清除能力高于ABTS的清除能力。然而，抗壞血酸含量相對(duì)較低，致使避免芳香化合物氧化能力減弱[20]。

2.2 有機(jī)酸的比較分析

如表2所示，樣品間有機(jī)酸總含量在9.53～58.76 g/L，從而導(dǎo)致總酸顯著不同。顯然，檢出的5種有機(jī)酸中檸檬酸是優(yōu)勢有機(jī)酸，所占比例在78.36%～89.58%，主要是源于青梅，且含量高于浸泡型青梅酒[3]。除第3輪原酒外，含量次之的是蘋果酸，且其含量在樣品間存在顯著差異，它有助于酒中芳香化合物的釋放，提高果酒的鮮味[3]。第3輪，因蔗糖經(jīng)酵母發(fā)酵，琥珀酸成為主要代謝產(chǎn)物之一[21]。此外，后兩輪樣品中檢出了少量乳酸，可能是蘋果酸-乳酸發(fā)酵[22]所致。除ZD外，乙酸含量與揮發(fā)酸含量呈正相關(guān)，且3輪的單培接種都高于共培接種。

表2 有機(jī)酸含量的差異 單位：g/L

2.3 揮發(fā)性組分的差異

原酒樣品中共檢出了69種揮發(fā)性成分(>0.1%)，包括酯(29)、醇(14)、酸(10)、醛(4)、酚(4)和萜(8)等6類，所有樣品都檢出的成分有31種，部分揮發(fā)性成分含量差異如圖1-a所示。

S和S+T的3輪發(fā)酵的原酒中第2輪揮發(fā)性成分的含量最高，對(duì)照樣品ZR最低。ZD的總揮發(fā)物高于S和S+T的第1輪原酒的，且顯著高于ZR的。ZD與ZR的酯類的比例相似，前者的酸類的比例較后者高，萜烯類比例則低。如圖1-b所示，酵母強(qiáng)化顯著提高了醇類組分的比例，單培接種的酸類組分比例隨發(fā)酵輪次減少而共培接種的則先減少后增加，酯類的比例是略減，S+T第2輪的萜烯類組分的比例略增。

醇和酯是優(yōu)勢組分，前者主要是苯乙醇和異戊醇，與曾報(bào)道的結(jié)果[23-24]是一致的，酸類次之。酯類組分中，主要是辛酸、癸酸、琥珀酸、乙酸和苯甲酸等5種酸的乙酯衍生物，這些組分賦予青梅酒果香和花香。S和S+T的原酒中，檢出了賦予樣品甜味、柑橘味、花香的癸醛。浸泡型青梅酒中檢出的賦予杏仁香氣的特征組分苯甲醛[25]，本研究在除S外的樣品中也都檢出，HAN等[4]也有類似的報(bào)道，可能是源于青梅(核)[26]。4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、乙基酚等對(duì)葡萄酒特征風(fēng)味貢獻(xiàn)顯著[27]，S.cerevisiae抑制了Brettanomyces/Dekkera生長與代謝所致[28]，所有強(qiáng)化的樣酒中都未檢出。萜烯類含量盡管較低，但閾值小，所以其含量變化顯著影響果酒花香和果香等特征風(fēng)味。

圖1 揮發(fā)性成分含量(a)及相對(duì)含量(b)的差異Fig.1 Difference of volatile compounds content (a) and relative content (b)

主要香氣化合物的氣味活度值(odour activity value,OAV)如表3所示。主要香氣化合物、有機(jī)酸和理化指標(biāo)的PLS-DA的結(jié)果如圖2所示。這些原酒彼此距離較遠(yuǎn)，其72.50%的總方差可被解釋。類似HU等[29]報(bào)道的結(jié)果，酵母接種方式顯著影響原酒的代謝組成。在這些香氣化合物中，有14種物質(zhì)的變量投影重要性(variable importance in the projection，VIP)>1，如β-紫羅蘭酮、異戊醇、苯乙醇等，這些物質(zhì)對(duì)PLS-DA模型的方差貢獻(xiàn)較大[30]，且殘?zhí)呛途凭鹊腣IP>1。模型的RX2、RY2和Q2的值(0.91、0.979和0.905)表明，PLS-DA模型較準(zhǔn)確地揭示發(fā)酵所致青梅酒品質(zhì)的差異。

圖2 青梅原酒的PLS-DAFig.2 PLS-DA of greengage wines

表3 主要香氣化合物氣味活度值Table 3 Odour activity values of major aroma compounds

2.4 不同青梅酒風(fēng)味輪廓的差異

以揮發(fā)性成分濃度除以相應(yīng)閾值的OAVs評(píng)估其對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)，通常OAV>1的貢獻(xiàn)度顯著[31]。OAV>1的共有9種成分，包括γ-癸內(nèi)酯、癸醛、β-紫羅蘭酮、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂酸乙酯和己酸乙酯，構(gòu)建其風(fēng)味輪廓如圖3所示。這些成分除丁酸乙酯和癸醛外，在所有原酒中都有檢出。肉桂酸乙酯閾值非常低，因而OAV在各樣品中最高，賦予了原酒梅果香、肉桂香和花香，且自然發(fā)酵的梅果香更濃。強(qiáng)化發(fā)酵的原酒因接種方式及輪次不同導(dǎo)致OAV不同，其特征風(fēng)味有差異，主要是花香、蜜香、菠蘿果香、脂肪味和果香的芳香強(qiáng)度不同。

2.5 微生物多樣性分析

接種方式對(duì)主要發(fā)酵過程微生物α-多樣性的影響結(jié)果如表4所示。強(qiáng)化發(fā)酵提高了細(xì)菌豐富度和多樣性。但在S+T的后期，真菌豐富度小于自然發(fā)酵樣品，S+T和S在中期，真菌多樣性顯著低于自然發(fā)酵樣品。S在后期真菌多樣性顯著高于S+T，但仍低于ZR。

圖3 青梅原酒的風(fēng)味輪廓圖Fig.3 Flavor profile of greengage wines

表4 不同樣品α-多樣性差異Table 4 Difference of α-diversity in different samples

自然發(fā)酵及強(qiáng)化的中、后期的群落組成的差異如圖4所示。強(qiáng)化方式顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)，尤其在發(fā)酵中期，這是研究微生物組成及代謝組分關(guān)系的關(guān)鍵時(shí)期[32]。S.cerevisiae強(qiáng)化后，在發(fā)酵中期成為優(yōu)勢菌，在S和S+T中的豐度>91.50%，Pichia的豐度顯著降低(圖4-b)。自然發(fā)酵的ZR和ZD則在發(fā)酵后期才檢出S.cerevisiae。這些結(jié)果證實(shí)了接種酵母菌的主要作用之一是縮短發(fā)酵時(shí)間。KONG等[33]報(bào)道了在葡萄酒發(fā)酵中Saccharomyces和Pichia具有良好的互作關(guān)系，在青梅酒的發(fā)酵中后期情況亦是如此。然而Saccharomyces和Torulaspora系偏生關(guān)系，S+T的Torulaspora的豐度<0.01%。在ZR和ZD后期發(fā)酵醪中檢出Dekkera的豐度較高，這也是揮發(fā)性乙基酚的產(chǎn)生原因[28]。對(duì)于細(xì)菌屬，在S、S+T和ZR中Sphingomonas是優(yōu)勢菌，可能與發(fā)酵過程常攪拌、溶氧較高有關(guān)，所以其細(xì)菌菌群組成非常類似(圖4-a)。而ZD中Gluconobacter和Acetobacter是優(yōu)勢菌，直到發(fā)酵后期才與ZR的細(xì)菌群落趨于相同。

a-細(xì)菌；b-真菌圖4 屬水平上細(xì)菌和真菌的微生物組成Fig.4 Microbial compositions of bacteria and fungi at genus level

進(jìn)一步對(duì)1輪原酒中后期微生物群落進(jìn)行了主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)分析和層次聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)，結(jié)果如圖5所示。細(xì)菌方面，S+T和S同對(duì)照樣品ZR在發(fā)酵中期因細(xì)菌群落相似(圖5-a)而聚為一簇(圖5-c)，ZD則單獨(dú)聚為一簇；發(fā)酵后期，接種強(qiáng)化的樣品細(xì)菌群落組成與發(fā)酵中期相比略有差異，ZR和ZD細(xì)菌群落組成趨于一致但因變化較大而遠(yuǎn)離接種強(qiáng)化的樣品。真菌方面，S+T和S發(fā)酵前期因真菌群落組成重疊性較大(圖5-b)而聚為一簇(圖5-d)，且遠(yuǎn)離ZR和ZD；而在發(fā)酵后期，與細(xì)菌不同，接種強(qiáng)化的樣品因菌株不同和順序接種而逐漸遠(yuǎn)離。

a-一輪細(xì)菌PCoA；b-一輪真菌PCoA；c-一輪細(xì)菌HCA；d-一輪真菌HCA圖5 屬水平上細(xì)菌和真菌的主坐標(biāo)分析和層次聚類分析Fig.5 PCoA and HCA of bacteria and fungi at genus level

第1輪原酒的主要揮發(fā)性成分與微生物組成的RDA結(jié)果如圖6所示。

a-發(fā)酵中期；b-發(fā)酵后期圖6 微生物與香氣化合物的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between microbes and aroma compounds

在發(fā)酵中期(圖6-a)，接種的S.cerevisiae的豐度與己酸乙酯、苯甲酸甲酯、乙酸異戊酯、異戊醇、橙花叔醇、法尼醇、癸醛等的含量呈顯著正相關(guān)，T.delbrueckii的豐度與這些組分也呈正相關(guān)，但由于Saccharomyces和Torulaspora系偏生關(guān)系而相關(guān)性較弱。Pichia的豐度與肉桂酸、棕櫚酸、乙酸、乳酸等4種酸的乙酯及γ-癸內(nèi)酯等的含量呈正相關(guān)，對(duì)這些香氣成分貢獻(xiàn)度較大。而在發(fā)酵后期(圖6-b)，Dekkera的豐度與4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量呈正相關(guān)，且在發(fā)酵中期與接種酵母呈強(qiáng)烈競爭關(guān)系的Pichia在發(fā)酵后期則與Saccharomyces表現(xiàn)出良好的協(xié)同關(guān)系。

3 結(jié)論

3種接種方式對(duì)青梅酒的理化特性和代謝組分的影響規(guī)律的研究結(jié)果表明，強(qiáng)化發(fā)酵提高了酒精度及自由基清除能力，降低了總酸和揮發(fā)酸的含量，且第2輪的糖酸平衡較好。青梅因酸度高，首輪發(fā)酵抑制了酵母菌，其乙醇濃度略低于后兩輪的。菌株不同及順序接種影響乙醇、代謝組分的含量，接種強(qiáng)化提高了醇類組分的比例，減少了酸類組分的比例，單培的后兩輪乙醇含量更高而共培的第2輪的萜烯類比例略增。強(qiáng)化導(dǎo)致4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和乙基酚等特征組分含量顯著降低，突出了萜烯類組分對(duì)風(fēng)味組分的貢獻(xiàn)度，花香和果香更濃郁。對(duì)1輪原酒微生物多樣性研究結(jié)果表明，強(qiáng)化顯著改變青梅酒的微生物群落結(jié)構(gòu)。S.cerevisiae和T.delbrueckii的貢獻(xiàn)類似，主要是提高了己酸乙酯、苯甲酸甲酯、乙酸異戊酯、異戊醇、橙花叔醇、法尼醇、癸醛等的含量。研究結(jié)果為解決原料酸度高影響產(chǎn)品品質(zhì)，及基于釀酒酵母和非釀酒酵母共培養(yǎng)的發(fā)酵果酒過程參數(shù)優(yōu)化奠定了理論基礎(chǔ)。