醬油發(fā)酵過程中一株4-乙基愈創(chuàng)木酚轉(zhuǎn)化菌的篩選及鑒定

郭明威，耿予歡

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510641)

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，與人們的生活息息相關(guān)。醬油發(fā)酵是多種微生物共同作用的過程，經(jīng)過微生物及其酶系的長(zhǎng)期作用，賦予了醬油良好的風(fēng)味[1]。4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-ethyl guaiacol, 4-EG)，分子式為C9H12O2，呈發(fā)酵香氣，微帶酚的氣息，通常被描述為一種煙熏味和丁香味的物質(zhì)，存在于日本醬油和中國(guó)傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油，其香氣很受消費(fèi)者歡迎[2]。4-EG風(fēng)味閾值極低，其含量相差0.5 mg/L就很容易被感官識(shí)別，有文獻(xiàn)認(rèn)為，1～2 mg/L的4-EG便可明顯改善醬油的風(fēng)味品質(zhì)[3]。因此，4-EG的含量與醬油的品質(zhì)存在較為密切的關(guān)系。

4-EG可以通過化學(xué)合成，也可以從天然植物中提取，或者通過生物轉(zhuǎn)化法制備，工業(yè)化生產(chǎn)主要是通過化學(xué)合成途徑進(jìn)行的[4]。由于人造食品的潛在危害，人們對(duì)天然食品的需求持續(xù)增長(zhǎng)，但是從天然植物中提取4-EG的量非常有限，不能滿足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求[5-6]。而生物催化轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、底物專一性好、工藝環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展迅速[7-8]。

近些年，有關(guān)生物催化轉(zhuǎn)化方式的研究較多。董永勝等[9]發(fā)明了一種利用環(huán)狀芽孢桿菌和酒香酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生4-EG的方法。王少磊等[10]從濃香型大曲中篩選到1株產(chǎn)4-EG的菌株。肖澎等[4, 11]探究了阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性酚的途徑，由FA轉(zhuǎn)化生成4-EG的途徑分為2步：首先FA在脫羧酶的作用下可轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-vinyl guaiacol，4-VG)，隨后4-VG通過還原酶的作用轉(zhuǎn)化為4-EG。SUN等[12]研究了以米糠為原料制備FA粗提液，并利用地衣芽孢桿菌發(fā)酵進(jìn)一步產(chǎn)生4-VG的方法。然而在醬油釀造過程中，利用生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生4-EG的研究目前報(bào)道較少，本研究主要對(duì)高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中能夠產(chǎn)生4-EG的菌株進(jìn)行篩選、鑒定，并探討菌株的生長(zhǎng)特性，以期為提高傳統(tǒng)醬油產(chǎn)品中4-EG的含量奠定相關(guān)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

樣品：菌種篩選原料由廣東某食品有限公司提供；曲料和醬醪取自制曲車間和發(fā)酵缸。

試劑：FA、4-EG，麥克林生化科技有限公司；4-VG，上海阿拉丁試劑有限公司；細(xì)菌DNA試劑盒，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，廣州叢源試劑有限公司。

儀器設(shè)備：LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋、DNP-9082生化恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，深圳市永盛旺實(shí)業(yè)有限公司；THZ-82恒溫振蕩培養(yǎng)箱，常州恩培儀器有限公司；KH20A臺(tái)式高速離心機(jī)，上海析域儀器設(shè)備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；U3000高效液相色譜儀，賽默飛科技有限公司；Agilent 7000C三重串聯(lián)四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；IX73熒光倒置顯微鏡，奧林巴斯有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.1 g，蛋白胨 1 g，溶于100 mL去離子水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：同LB液體培養(yǎng)基配制方法，再加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：FA 0.1 g，酵母膏1 g，KH2PO40.09 g，Na2HPO41 g，MgSO40.02 g，CaCl20.01 g，溶于100 mL蒸餾水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌株的分離

分別稱取10 g發(fā)酵醬醪、發(fā)酵成曲，在無菌條件下研磨成粉末加入到250 mL三角瓶中，同時(shí)加少數(shù)玻璃珠和90 mL生理鹽水，在30 ℃，160 r/min條件下振蕩20 min制成10-1菌種懸浮液，再用無菌生理鹽水將懸液梯度稀釋至10-4～10-7。取0.1 mL濃度為10-4～10-7的菌種懸液涂布于LB平板上30 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h[13]。

根據(jù)菌落的形態(tài)特征等挑取單菌落在LB平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h，得到產(chǎn)4-EG菌株的單克隆。將純化的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，置于甘油-20 ℃保藏[14]。

1.2.3 4-EG產(chǎn)生菌株的篩選

從菌株斜面上挑取菌落接至LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，160 r/min搖床培養(yǎng)24 h制成瓶種。將種子液以5%的接種量(體積分?jǐn)?shù))接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d[15]。

移取發(fā)酵液10 mL，加同等體積二氯甲烷，混勻靜置5 min，8 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，待分層后取下層清液，以上操作重復(fù)3次，合并萃取液，加5 g無水硫酸鈉冷凍過夜除去水分，用韋氏蒸餾柱濃縮至5 mL(60 ℃保持微沸)，氮?dú)獯祾邼饪s至2 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，用GC-MS/選擇離子監(jiān)測(cè)(selective ion monitoring, SIM)法進(jìn)行檢測(cè)分析。根據(jù)GC-MS檢測(cè)結(jié)果選取目標(biāo)菌株進(jìn)行下一步分析鑒定[16]。

色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；恒流：1.0 mL/min；分流比15∶1；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：初溫50 ℃，以8 ℃/min升溫至100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至170 ℃保持3 min，以15 ℃/min升溫到235 ℃，保持4 min，總分析時(shí)間29.58 min[17]。

質(zhì)譜條件：電子電離源，能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度240 ℃。定性采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500；定量采用SIM，4-EG的特征離子為：m/z137/152/122[18]。

1.2.4 目標(biāo)菌株發(fā)酵過程各種物質(zhì)含量的測(cè)定

將初篩所得目標(biāo)菌株活化培養(yǎng)成種子液，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 d，每2 d 取10 mL樣品過濾離心后保存至4 ℃冰箱，發(fā)酵結(jié)束用HPLC檢測(cè)樣品中FA、4-VG及4-EG的相對(duì)含量，探究菌株發(fā)酵過程中3種物質(zhì)的含量變化[19]。

HPLC條件：Waters Atlantis?T3反相C18色譜柱 (5 μm×4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相：A為甲醇，B為1%甲酸水；洗脫程序：0～15 min，100%～48% B；15～20 min，48% B；20～30 min，48%～30% B；30～35 min，30% B；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為0～18 min，320 nm；18～35 min，280 nm。

制定標(biāo)準(zhǔn)曲線：取標(biāo)準(zhǔn)品FA、4-VG、4-EG，溶于甲醇配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋為：20、40、60、80、100 mg/L。用HPLC測(cè)定，甲醇為空白對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性方程[20]。

1.2.5 菌株鑒定

1.2.5.1 形態(tài)特征觀察

經(jīng)過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選的目標(biāo)菌株，將其菌懸液梯度稀釋后涂布于LB平板培養(yǎng)基，置于35 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌體在固體平板上的形狀、顏色、黏稠度、透明度等特征，提取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察菌體的顯微形態(tài)[21]。

1.2.5.2 菌株生理生化鑒定

菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)參考第九版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及東秀珠所著《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，主要包括蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖等糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸等氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)，過氧化氫酶、脲酶、檸檬酸鹽利用、甲基紅實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、明膠水解、酪素水解等[12]。

1.2.5.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

用試劑盒提取菌株基因組，采用16S rDNA通用引物，以目標(biāo)菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果正確的樣品送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)定16S rDNA序列。

測(cè)序結(jié)果拼接后導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性BLAST比對(duì)，然后下載比對(duì)相似度在99.8%以上的前10個(gè)菌種的DNA序列，并利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次bootstraps檢驗(yàn)計(jì)算支持率[10]。

1.2.6 目標(biāo)菌株生物學(xué)特性研究

1.2.6.1 形態(tài)特征觀察

將目標(biāo)菌株等量接種到裝有10 mL培養(yǎng)基的試管中，分別在不同溫度，轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，溫度分別為25、28、30、32、35、37、40、42 ℃，空白對(duì)照為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處OD值[13]。

1.2.6.2 生長(zhǎng)曲線

將目標(biāo)菌株等量接種到裝有10 mL培養(yǎng)基的試管中，置于30 ℃、160 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h，將標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的試管取出，立即放4 ℃冰箱保存，空白對(duì)照為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處OD值。

1.2.6.3 耐鹽性

將目標(biāo)菌株等量接種到不同NaCl濃度的LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%，空白對(duì)照為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處OD值[13]。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Microsoft Office Excel 2010處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 4-EG產(chǎn)生菌株篩選

將菌種原料進(jìn)行多次稀釋涂布培養(yǎng)和劃線分離，根據(jù)平板上菌落特征初步篩選分離獲得10種菌株，根據(jù)分離時(shí)間順序給菌株進(jìn)行編號(hào)。將分離到的10株單菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，以4-EG含量為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照，用GC-MS/SIM法檢測(cè)發(fā)酵樣品中的4-EG的含量，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Results of strain screening

由表1可知，菌株G02、G03、G08均可利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的FA產(chǎn)生4-EG，其中菌株G08的產(chǎn)4-EG能力最強(qiáng)，該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的4-EG含量可達(dá)28.49 mg/L，因此選取該菌株做下一步分析鑒定。

2.2 菌株G08發(fā)酵過程各種物質(zhì)含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及線性關(guān)系考察

標(biāo)準(zhǔn)混合樣品的液相色譜圖如圖1所示

1-FA(17.4 min)；2-4-VG(24.6 min)；3-4-EG(27.2 min)圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合樣品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of mixed standards

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中的物質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/L)和HPLC標(biāo)準(zhǔn)色譜圖峰面積分別為橫縱坐標(biāo)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。FA的回歸方程：y=0.952 8x-2.922 1，R2=0.996 6；4-VG的回歸方程：y=0.471 8x-0.236 8，R2=0.998 7；4-EG的回歸方程：y=0.250 2x-0.463 5，R2=0.998 6。

2.2.2 菌株G08發(fā)酵過程物質(zhì)含量變化

將菌株G08活化培養(yǎng)成種子液，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min恒溫發(fā)酵12 d，每2 d取10 mL樣品過濾離心后保存至4 ℃冰箱，發(fā)酵結(jié)束后用HPLC檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)段的樣品中FA、4-VG及4-EG的相對(duì)含量，結(jié)果如圖2所示。

在菌株G08發(fā)酵前期，F(xiàn)A的含量在迅速降低，而4-VG的含量在不斷升高，由此表明這一階段的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)以FA脫羧生成4-VG為主。從第4天開始FA的含量基本穩(wěn)定在190 mg/L，與此同時(shí)4-VG的含量在第4天達(dá)到最高為178 mg/L，隨后開始逐漸降低，到第8天穩(wěn)定在65 mg/L，而4-EG的含量則緩慢升高，且由第8天開始含量增速明顯加快，到第12天達(dá)到最高為62 mg/L，由此可估算4-EG的摩爾轉(zhuǎn)化率為7.92%。

圖2 G08發(fā)酵過程中物質(zhì)含量變化Fig.2 Changes of substance content during G08 fermentation

2.3 菌株G08的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征鑒定

菌株G08經(jīng)生理鹽水稀釋后涂布在LB平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，菌落幼期為乳白色，成熟期為淡黃色，不透明，形狀規(guī)則，中央隆起，表面黏稠，邊緣整齊(圖3-a)；在液體培養(yǎng)基中菌體成團(tuán)，菌液渾濁，可產(chǎn)生菌膜；在顯微鏡下觀察顯微形態(tài)，菌體為不規(guī)則短桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢(圖3-b)。

a-菌落形態(tài)；b-顯微形態(tài)圖3 菌株G08的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain G08

2.3.2 菌株生理生化鑒定

菌株G08的生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。該菌株可氧化發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖，發(fā)酵過程中產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，不能夠利用木糖。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第九版)》的現(xiàn)有菌株特性進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株G08的生理生化特性與芽孢桿菌屬十分相似，可以初步判斷為芽孢桿菌，還需通過分子生物學(xué)鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2菌株G08的生理生化特性Table 2 Biochemical and physiological characters of strain G08

2.3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

以菌株G08基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳試驗(yàn)，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，擴(kuò)增片段分子質(zhì)量大約在1 200～1 500 bp，條帶清晰明亮且不存在非特異性擴(kuò)增，表示16S rDNA 擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行測(cè)序，確定該片段的實(shí)際長(zhǎng)度為1 368 bp。

圖4 菌株G08的16S rDNA凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis pattern of PCR amplified product of 16S rDNA from strain G08

將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示菌株G08與芽孢桿菌屬的幾個(gè)菌種的同源性均達(dá)到99.8%，可判定該菌株屬于芽孢桿菌屬。經(jīng)多序列同源性分析，得到10個(gè)同源性大于99.8%的菌株，用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得菌株G08的系統(tǒng)發(fā)育地位，系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示。結(jié)果表明菌株G08與Bacillussubtilis屬于同一分支，綜合該菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，判斷該菌株是芽孢桿菌屬中的一個(gè)種，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為BacillussubtilisG08。

圖5 菌株G08基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of strain G08

2.4 菌株G08的生物學(xué)特性

2.4.1 最適生長(zhǎng)溫度

由圖6可知，菌株G08的最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，低于35 ℃時(shí)，隨溫度的升高，OD600值緩慢遞增；當(dāng)高于35 ℃時(shí)，隨溫度的升高，OD600值逐漸遞減。

圖6 菌株G08的最適生長(zhǎng)溫度Fig.6 The optimum growing temperature for strain G08

2.4.2 生長(zhǎng)曲線

由圖7可知，在培養(yǎng)初期(0～10 h)菌株G08生長(zhǎng)較為緩慢，為生長(zhǎng)遲緩期；培養(yǎng)中期(10～16 h)生長(zhǎng)速度明顯加快，為對(duì)數(shù)增殖期；16 h后生長(zhǎng)速度開始減緩，到18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600值基本不發(fā)生明顯改變。

圖7 菌株G08的生長(zhǎng)曲線Fig.7 The growth curve of strain G08

2.4.3 耐鹽性

由圖8 可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%時(shí)，隨著NaCl含量的升高，菌株G08的OD600值呈遞增趨勢(shì)，由此說明適量的NaCl有助于該菌株生長(zhǎng)增殖；而NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于5%時(shí)，菌株OD600值明顯減小；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7%～9%時(shí)，菌株還能夠正常生長(zhǎng)；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于9%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于11%時(shí)，菌株基本難以生長(zhǎng)，由此可判斷菌株G08對(duì)NaCl的耐受性為9%。

圖8 菌株G08的耐鹽性Fig.8 The salt tolerance of strain G08

3 結(jié)論

本研究以FA為主要原料的培養(yǎng)基，以菌株發(fā)酵產(chǎn)物中4-EG的含量為參考標(biāo)準(zhǔn)，從傳統(tǒng)中式醬油的醬醪、成曲中分離篩選到1株能夠?qū)A轉(zhuǎn)化4-EG的菌株G08，并探究了其轉(zhuǎn)化過程中FA、4-VG及4-EG的含量變化。采用形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析等方法判斷該菌株屬于枯草芽孢桿菌。該菌株在轉(zhuǎn)化FA成為4-EG的能力上優(yōu)于其他菌株，4-EG的摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)到7.92%。現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道一些耐鹽酵母和芽孢桿菌有類似的轉(zhuǎn)化能力，但如何將這類菌株與米曲霉、黑曲霉等醬油生產(chǎn)所用的常規(guī)菌種綜合利用，有效開發(fā)麩皮、米糠、甜菜粕等農(nóng)副產(chǎn)品中的阿魏酸，通過多菌種不同階段連續(xù)發(fā)酵的方式提高醬油中4-EG的含量，需要結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐進(jìn)一步研究。