低產(chǎn)乙醇本土有孢漢遜酵母的篩選及釀造特性

馮文倩，王倩,2，劉延琳,2，宋育陽,2，姜嬌,2，伍新宇，秦義,2*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100) 2(西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 合陽，715300) 3(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，新疆 烏魯木齊，830043)

由于全球氣候變暖，葡萄成熟時(shí)的含糖量越來越高，導(dǎo)致葡萄酒酒度不斷升高[1]。在過去30年的時(shí)間里，全球葡萄酒的酒精度平均上升了約2%(乙醇體積分?jǐn)?shù)，下同)[2-3]。在我國西北部分葡萄酒產(chǎn)區(qū)，特別是近10年來，葡萄完全成熟時(shí)的含糖量甚至超過270 g/L，從而導(dǎo)致葡萄酒最終酒精度超過15%。較高的酒精度不利于酒體平衡，也影響葡萄酒的香氣和風(fēng)味[4]。利用葡萄栽培技術(shù)、葡萄酒物理脫醇技術(shù)和微生物技術(shù)等，可以在一定程度上降低葡萄酒的酒精度[5-6]，這其中，選育具有低產(chǎn)乙醇的酵母菌株將是最簡單和經(jīng)濟(jì)的方法。有研究顯示，假絲酵母屬(Candida)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、美奇酵母屬(Metschnikowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、Starmerella和Lachancea等酵母屬的部分菌株具有低產(chǎn)乙醇的特性，可以使葡萄酒的酒精度降低0.3%～3.8%[7-11]。

Hanseniaspora主要包括葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，仙人掌有孢漢遜酵母(Hanseniasporaopuntiae)、季也蒙有孢漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、葡萄園有孢漢遜酵母(Hanseniasporavineae)等。有研究表明H.uvarum的純種或混合發(fā)酵可以降低酒精含量，同時(shí)產(chǎn)生較低的揮發(fā)酸和更高的甘油、有機(jī)酸、醛類、醇類等次級代謝產(chǎn)物[12]。ROSSOUW等[10]利用H.opuntiae和H.uvarum發(fā)酵Pinotage，酒精度分別降低了0.6%和0.8%。GOBBI等[13]使用H.uvarum單獨(dú)發(fā)酵Verdicchio和Trebbiano，可使乙醇產(chǎn)量降低32.9%。ZHU等[14]篩選到2株乙醇產(chǎn)量及產(chǎn)率均低于釀酒酵母的H.uvarum06/4菌株，其乙醇產(chǎn)量減少了10%。但同時(shí)，大部分有孢漢遜酵母在葡萄酒生境下的生長能力較弱，因?yàn)檩^高的葡萄含糖量、酒精度的增加、發(fā)酵溫度的變化、SO2的添加等都可能會(huì)抑制有孢漢遜酵母的生長。

我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)分布廣、生態(tài)多樣，蘊(yùn)藏著豐富的有待開發(fā)的非釀酒酵母資源，而有孢漢遜酵母屬酵母是葡萄表皮和葡萄酒發(fā)酵早期主要的“土著”酵母屬，因此本研究以有孢漢遜酵母屬酵母為研究對象。為了獲得低產(chǎn)乙醇且釀造特性較好的本土有孢漢遜酵母菌株，本研究以從寧夏、甘肅、陜西和新疆分離獲得的53株有孢漢遜酵母為材料，首先利用模擬葡萄汁發(fā)酵，篩選出乙醇產(chǎn)率較低和生長速率較快的有孢漢遜酵母，并對其糖、乙醇、SO2、低pH、溫度耐受性、嗜殺性和產(chǎn)H2S特性等葡萄酒釀造學(xué)特性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

53株本土有孢漢遜酵母(分離自寧夏、甘肅、陜西和新疆)和1株釀酒酵母(分離自寧夏)，均保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，如表1所示。

表1 本研究使用的本土酵母菌株Table 1 Indigenous yeast strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，121 ℃高壓滅菌20 min。

YEPD-MB培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨20，酵母浸粉10，瓊脂20，亞甲基藍(lán)0.03，0.2 mol/L 磷酸檸檬酸緩沖溶液調(diào)pH值至4.6，121 ℃高壓滅菌20 min。

Triple M模擬汁[15]：葡萄糖100 g/L，果糖100 g/L，4 mL/L ergo stock(Tween-80 12.5 mL，95%乙醇 37.5 mL，麥角固醇 0.125 g)；L-(+)酒石酸 6 g/L，L-(-)蘋果酸 3 g/L，檸檬酸0.5 g/L；YNB 1.7 g/L，酸水解酪蛋白2 g/L，肌醇0.006 g/L，CaCl20.2 g/L，L-脯氨酸1 g/L，DL-色氨酸0.1 g/L，精氨酸0.8 g/L，(NH4)3PO41 g/L。KOH溶液調(diào)pH值至3.25，0.22 μm濾膜過濾除菌。

WL營養(yǎng)瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；BIGGY瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY—2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；AUX320分析天平，日本SHIMADZU公司；SX-500立式壓力蒸汽滅菌器，中國Techcomp公司；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國Bio Tek公司；BK1301生物顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；Spectra Max M2多功能微孔板檢測儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母培養(yǎng)

將保藏的酵母菌液劃線于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上挑取單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h制備酵母種子液。

1.3.2 低產(chǎn)乙醇有孢漢遜酵母的篩選

將53株有孢漢遜酵母及對照菌株釀酒酵母NX11424的活化菌液以2%的接種量接種于50 mL 模擬汁中，28 ℃、150 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，然后再將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液以1×106CFU/mL的接種量接種到裝有150 mL模擬葡萄汁的250 mL發(fā)酵瓶中發(fā)酵，發(fā)酵瓶用封口膜密封，25 ℃靜置發(fā)酵，每個(gè)菌株設(shè)置3組平行。發(fā)酵過程中，每隔8 h對釀酒酵母取樣測定殘?zhí)呛虲O2失重，每24 h測定有孢漢遜酵母的CO2失重。當(dāng)糖含量<4 g/L或連續(xù)72 h CO2失重不再變化時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，通過比較各菌株的CO2失重速率、乙醇產(chǎn)量、乙醇產(chǎn)率、乙醇產(chǎn)率的變化率等指標(biāo)，篩選獲得低產(chǎn)乙醇的有孢漢遜酵母。

1.3.3 低產(chǎn)乙醇有孢漢遜酵母的發(fā)酵驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定所篩選有孢漢遜酵母的低產(chǎn)乙醇特性，將其和對照菌株NX11424再次進(jìn)行模擬發(fā)酵。

將待測有孢漢遜酵母及對照菌株釀酒酵母NX11424的活化菌液，以2%的接種量接種于50 mL模擬汁中，28 ℃、150 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，然后再將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液以1×106CFU/mL的接種量接種到裝有150 mL模擬葡萄汁的250 mL發(fā)酵瓶中發(fā)酵，發(fā)酵瓶用封口膜密封，25 ℃靜置發(fā)酵，每個(gè)菌株設(shè)置3組平行。利用移液槍在超凈工作臺(tái)進(jìn)行無菌取樣，每次取樣體積均等且控制在1 mL。通過測定發(fā)酵液的還原糖含量監(jiān)控發(fā)酵過程(釀酒酵母：每24 h測定1次；有孢漢遜酵母：發(fā)酵前期，每48 h測定1次，發(fā)酵后期，每72 h測定1次)。發(fā)酵結(jié)束后，測定各菌株的理化指標(biāo)。

1.3.4 優(yōu)選有孢漢遜酵母的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增液送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件與已知序列進(jìn)行同源比對分析。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，用Clustal X軟件對優(yōu)選菌株和相關(guān)模式菌株的多個(gè)序列進(jìn)行匹配分析(Alignment)，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗(yàn)。

1.3.5 四株有孢漢遜酵母菌株的工藝學(xué)性狀

1.3.5.1 糖耐受性

在YEPD液體培養(yǎng)基中加入葡萄糖，使其葡萄糖質(zhì)量濃度分別為100、150、200、250、300、350 和400 g/L，經(jīng)過濾除菌后，將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，使用酶標(biāo)儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.2 酒精耐受性

在滅菌之后的YEPD液體培養(yǎng)基中加入無水乙醇調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%，將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，使用酶標(biāo)儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.3 SO2耐受性

在滅菌之后的YEPD液體培養(yǎng)基中加入H2SO3調(diào)整SO2質(zhì)量濃度為60、120、180、240、300、360和420 mg/L，將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，使用酶標(biāo)儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.4 溫度耐受性

將酵母種子液以1×106CFU/mL的接種量接種于已滅菌的YEPD液體培養(yǎng)基中，分別置于溫度為10、15、20、25、30、35和40 ℃的培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，使用酶標(biāo)儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.5 低pH耐受性

用磷酸-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)YEPD液體培養(yǎng)基的pH值分別為2.8、3.2、3.6、4.0，滅菌后接種酵母種子液，接種量為1×106CFU/mL，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，使用酶標(biāo)儀測定各菌株的OD600。

1.3.5.6 酵母嗜殺性測定

將釀酒酵母NX11424細(xì)胞計(jì)數(shù)后用無菌水稀釋至107CFU/mL后涂布于YEPD-MB培養(yǎng)基，然后取5 μL非釀酒酵母菌液點(diǎn)樣在涂有釀酒酵母的YEPD-MB培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。若非釀酒酵母菌株為嗜殺菌株，其菌落周圍會(huì)形成藍(lán)色死菌帶和透明抑菌圈[16]。

1.3.5.7 酵母產(chǎn)H2S特性檢驗(yàn)

將5 μL非釀酒酵母菌液點(diǎn)樣于BIGGY培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落顏色。一般H2S產(chǎn)量由低到高對應(yīng)菌落顏色分別為白色(不產(chǎn))、黃棕色(低產(chǎn))、褐色(中產(chǎn))和黑色(高產(chǎn))[17]。

1.3.6 理化指標(biāo)測定

利用酶標(biāo)儀測定樣品在600 nm波長下的OD值；采用DNS法[18]測定殘?zhí)堑暮俊０凑誐egazyme乙醇試劑盒(K-ETOH)和BioSystems甘油試劑盒分別檢測乙醇和甘油。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測定總酸和揮發(fā)酸。

1.4 數(shù)據(jù)處理與指標(biāo)計(jì)算

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016進(jìn)行發(fā)酵數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多范圍檢驗(yàn)以確定數(shù)據(jù)之間的顯著差異(P<0.05)。利用Origin Pro 2018作圖。

1.4.2 指標(biāo)計(jì)算

乙醇產(chǎn)量/(g·L-1)=φ(乙醇)×10×0.789

(1)

式中：0.789為乙醇密度，g/mL[13]。

(2)

(3)

式中：A，供試有孢漢遜酵母發(fā)酵結(jié)束時(shí)的乙醇產(chǎn)率；B，當(dāng)釀酒酵母與供試有孢漢遜酵母消耗相同糖時(shí)，釀酒酵母的乙醇產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 低產(chǎn)乙醇有孢漢遜酵母菌株的篩選

對53株本土有孢漢遜酵母進(jìn)行模擬葡萄汁發(fā)酵，以乙醇產(chǎn)率作為主要評價(jià)指標(biāo)，以S.cerevisiaeNX11424為對照菌株，評估了有孢漢遜酵母菌株的產(chǎn)乙醇能力(表2)。有孢漢遜酵母的CO2最大失重速率明顯低于S.cerevisiaeNX11424，其中，葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)HuD-2-2的發(fā)酵速率較快，CO2最大失重速率達(dá)到0.48 g/(L·h)。有孢漢遜酵母的乙醇產(chǎn)率介于0.185～0.494 g/g，而S.cerevisiaeNX11424的乙醇產(chǎn)率為0.404 g/g。53株有孢漢遜酵母中，有28株酵母的乙醇產(chǎn)率低于S.cerevisiaeNX11424，降低幅度為3.78%～39.52%。

綜合分析CO2最大失重速率、糖利用率、乙醇產(chǎn)率及乙醇產(chǎn)率的變化率等指標(biāo)，初步篩選出4株低產(chǎn)乙醇且發(fā)酵速率較快的菌株，分別為H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2，其進(jìn)化關(guān)系如圖1所示。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2的糖利用率分別為86.94%、90.13%和98.77%、87.69%，乙醇產(chǎn)率分別降低了26.03%、22.33%和23.77%、32.05%。

表2 菌株的發(fā)酵相關(guān)參數(shù)Table 2 Fermentation parameters of the strains

續(xù)表1

圖1 四株有孢漢遜酵母的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of four Hanseniaspora strains

2.2 低產(chǎn)乙醇有孢漢遜酵母的進(jìn)一步發(fā)酵驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選獲得的4株有孢漢遜酵母菌株的乙醇合成能力，再次進(jìn)行模擬葡萄汁發(fā)酵。

2.2.1 四株有孢漢遜酵母菌株的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征

當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到12 d時(shí)，4株有孢漢遜酵母逐漸適應(yīng)了模擬葡萄汁環(huán)境，發(fā)酵速度均明顯加快，其中H.uvarumHuC-3-2的糖消耗速率最快，并于第21天完成發(fā)酵；H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2的發(fā)酵趨勢基本一致，發(fā)酵能力稍弱于H.uvarumHuC-3-2；H.opuntiaeHoA-1-3的發(fā)酵能力最弱，在30 d內(nèi)不能完成發(fā)酵(圖2-a和圖2-b)。盡管H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2均可以單獨(dú)完成葡萄模擬汁發(fā)酵，但在真實(shí)葡萄酒發(fā)酵過程中，通常需要將有孢漢遜酵母和釀酒酵母進(jìn)行混合接種發(fā)酵。

4株有孢漢遜酵母的乙醇產(chǎn)量明顯低于NX11424，其中H.opuntiaeHoA-1-3的乙醇產(chǎn)生速率最慢，其他3株有孢漢遜酵母產(chǎn)乙醇速率的趨勢相似(圖2-c)。發(fā)酵結(jié)束后，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2的酒精度分別為6.41%、8.47%、9.38%和8.48%。

2.2.2 四株有孢漢遜酵母菌株的代謝物

除H.opuntiaeHoA-1-3外，其他菌株的殘?zhí)呛烤? g/L以下。5株酵母菌株的酒精度和乙醇產(chǎn)率分別為6.41%～10.41%(體積分?jǐn)?shù))和0.317～0.417 g/g。與S.cerevisiaeNX11424相比，H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2的乙醇產(chǎn)率分別降低了23.87%、19.25%和10.74%、18.74%(表3)。

H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2的甘油產(chǎn)量均高于菌株S.cerevisiaeNX11424，分別增加了2.3%、4.7%和5.9%。此外，4株有孢漢遜酵母的揮發(fā)酸均高于S.cerevisiaeNX11424，揮發(fā)酸含量增加了12.3%～38.6%。甘油和揮發(fā)酸產(chǎn)量的增加，說明發(fā)酵底物碳源有更多的碳流向了甘油和乙酸的合成，這可能是4株有孢漢遜酵母乙醇產(chǎn)率降低的重要原因。

此外，模擬葡萄汁的總酸含量為9.0 g/L(以酒石酸計(jì))，發(fā)酵結(jié)束后，4株有孢漢遜酵母的降酸幅度(23.22%～27.78%)均高于S.cerevisiaeNX11424(20.67%)。因此，本研究篩選的4株有孢漢遜酵母在葡萄酒降酸方面也具有一定的應(yīng)用潛力。

2.3 四株有孢漢遜酵母菌株的釀造特性

2.3.1 糖耐受性

較高糖質(zhì)量濃度的葡萄汁會(huì)抑制酵母菌的生長，從而延長發(fā)酵時(shí)間[20]，而且高滲透壓也會(huì)影響酒精發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，如乙酸合成量的增加等[21]。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2均能夠耐受400 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度，但當(dāng)初始糖質(zhì)量濃度>300 g/L時(shí)，4株酵母的生長量呈現(xiàn)下降趨勢(圖3)。其中，H.opuntiaeHoA-1-3和H.uvarumHuB-2-2在初始糖質(zhì)量濃度為250 g/L時(shí)表現(xiàn)出生長抑制，H.uvarumHuC-3-2和H.opuntiaeHoC-4-2分別在初始糖質(zhì)量濃度為300和350 g/L時(shí)表現(xiàn)出生長抑制。綜合看來，H.opuntiaeHoA-1-3和HoC-4-2對高糖具有較好的耐受性，這對于高糖葡萄汁發(fā)酵的順利進(jìn)行具有重要意義。

2.3.2 酒精耐受性

酒精耐受性是酵母菌株重要的葡萄酒工藝學(xué)性狀。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2的生長受到高酒精含量的顯著抑制(圖4)。H.opuntiaeHoA-1-3和H.opuntiaeHoC-4-2可以耐受6%(體積分?jǐn)?shù))的酒精度，而H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2僅能耐受4%的酒精度。當(dāng)酒精度>6%時(shí)，4株有孢漢遜酵母盡管仍可以生長，但是生長趨勢極其微弱。在這部分的試驗(yàn)中出現(xiàn)了一個(gè)有意思的現(xiàn)象，即4株有孢漢遜酵母在YEPD培養(yǎng)基中酒精耐受性較弱，但是在模擬葡萄汁中卻能產(chǎn)生8%以上的酒精，這可能是由于4株有孢漢遜酵母在10余天的模擬葡萄汁發(fā)酵過程中經(jīng)歷了一個(gè)酒精度逐漸升高的適應(yīng)性馴化，這也間接反應(yīng)出這4株有孢漢遜酵母可能比較容易使用適應(yīng)性馴化或者理化誘變等方法進(jìn)行育種。

圖4 有孢漢遜酵母菌株的酒精耐受性Fig.4 Ethanol tolerance of the Hanseniaspora strains

對這4株有孢漢遜酵母開展以提高發(fā)酵速度為目標(biāo)的常壓室溫等離子體誘變育種，初步證實(shí)了上述猜想，1次誘變即可獲得大量的發(fā)酵速度加快的正向突變菌株。

2.3.3 SO2耐受性

如圖5所示，4株有孢漢遜酵母菌株在SO2質(zhì)量濃度<300 mg/L時(shí)均能很好地生長，且在不同質(zhì)量濃度下的生長沒有明顯差異。當(dāng)SO2質(zhì)量濃度達(dá)到360 mg/L時(shí)，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2的生長幾乎被完全抑制，但H.uvarumHuC-3-2在SO2質(zhì)量濃度達(dá)到420 mg/L時(shí)，生長才受到完全抑制。在葡萄原料衛(wèi)生狀況良好的情況下，釀造干型葡萄酒添加的SO2通常不超過60 mg/L。因此，從生產(chǎn)應(yīng)用的角度來看，SO2不是限制這些菌株應(yīng)用的因素。

圖5 有孢漢遜酵母菌株的SO2耐受性Fig.5 SO2 tolerance of the Hanseniaspora strains

2.3.4 溫度耐受性

發(fā)酵溫度是決定葡萄酒質(zhì)量的重要因素，酵母生長的最適溫度不同，低溫和高溫都會(huì)影響酵母菌的生長繁殖和發(fā)酵速率[22]。在葡萄酒釀造過程中，高溫菌株將提高發(fā)酵臨界溫度，降低發(fā)酵停滯的風(fēng)險(xiǎn)，而漢遜酵母屬是耐高溫酵母屬之一[23]。由圖6可知，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2都能在40 ℃高溫條件下正常生長，H.uvarumHuC-3-2的生長較弱。有研究表明部分非釀酒酵母比釀酒酵母能更好地在10～15 ℃的低溫條件下發(fā)酵，發(fā)酵前的冷浸漬也有利于有孢漢遜酵母的生長[24-25]，而本研究的4株有孢漢遜酵母菌株均能在10 ℃的低溫下生長，且當(dāng)培養(yǎng)溫度為20 ℃時(shí)，菌株的生長量均達(dá)到最大值。

2.3.5 低pH耐受性

葡萄汁的pH值通常在3.0～4.0[20]，因此葡萄酒釀造用酵母菌需要具有較強(qiáng)的耐酸性能。H.opuntiaeHoA-1-3、HoC-4-2和H.uvarumHuB-2-2、HuC-3-2在pH 2.8～4.0均能很好的生長，尤其是H.uvarumHuC-3-2在不同pH值條件下的生長量均高于其他菌株(圖7)，因此，從pH值耐受性角度看，本研究的4株有孢漢遜酵母菌均可滿足葡萄酒生產(chǎn)要求。

圖6 有孢漢遜酵母菌株的溫度耐受性Fig.6 Temperature tolerance of the Hanseniaspora strains

圖7 有孢漢遜酵母菌株的pH耐受性Fig.7 pH tolerance of the Hanseniaspora strains

2.3.6 嗜殺特性

嗜殺酵母在其生長繁殖過程中會(huì)分泌嗜殺毒素，但對自身產(chǎn)生的毒素具有免疫功能[26]。4株有孢漢遜酵母周圍均未出現(xiàn)藍(lán)色抑菌圈，說明這4株有孢漢遜酵母對S.cerevisiaeNX11424均無嗜殺作用(圖8)。對S.cerevisiae沒有嗜殺活性，將有利于這4株有孢漢遜酵母和S.cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵。

圖8 有孢漢遜酵母菌株的嗜殺性Fig.8 Killing activity of the Hanseniaspora strains

2.3.7 產(chǎn)H2S特性

H2S具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，較低的嗅覺閾值(50～80 μg/L)，過高會(huì)使葡萄酒具有臭雞蛋氣味，影響葡萄酒的香氣質(zhì)量，破壞葡萄酒的風(fēng)味[18]。5株酵母菌株在BIGGY培養(yǎng)基上的顯色如圖9所示，S.cerevisiaeNX11424和H.uvarumHuB-2-2屬于中產(chǎn)H2S菌株，H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuC-3-2均為不產(chǎn)H2S菌株。

圖9 酵母菌株的產(chǎn)H2S特性Fig.9 H2S production capacity of the yeast strains

3 結(jié)論

本研究以寧夏、甘肅、陜西和新疆葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離的53株有孢漢遜酵母為研究對象，利用模擬葡萄汁發(fā)酵篩選獲得H.opuntiaeHoA-1-3、H.opuntiaeHoC-4-2、H.uvarumHuB-2-2和H.uvarumHuC-3-2等4株具有低產(chǎn)乙醇性狀的有孢漢遜酵母屬酵母，其乙醇產(chǎn)率分別降低23.87%、19.25%、10.74%和18.74%。4株有孢漢遜酵母均能耐受400 g/L的糖、300 mg/L的SO2、pH 2.8、10 ℃低溫和40 ℃高溫，均無嗜殺活性；除H.uvarumHuB-2-2外，其他3株有孢漢遜酵母均不產(chǎn)H2S。整體而言，本研究篩選獲得的H.opuntiaeHoC-4-2和H.uvarumHuC-3-2在低產(chǎn)乙醇的同時(shí)，還具有較好的生長特性、耐受能力、發(fā)酵性能等釀造學(xué)特性，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

為了將其應(yīng)用于真實(shí)的葡萄酒釀造，在后續(xù)的研究工作中，一方面需要進(jìn)一步研究4株有孢漢遜酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵技術(shù)，以及其對葡萄酒感官質(zhì)量的影響；另外，可以這4株有孢漢遜酵母為出發(fā)菌株，通過物理化學(xué)誘變或者適應(yīng)性進(jìn)化等育種手段，選育具有更優(yōu)秀釀造學(xué)特征的低產(chǎn)乙醇酵母菌株，從而實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。