miR-126對人喉鱗癌Hep2細胞遷移侵襲能力的影響

沙海濱 尹麗娥 馬榮峰 徐佳鴻

(1勝利油田中心醫院，山東 東營 257000；2山東省省立醫院)

喉癌是成人頭頸部常見的一種惡性腫瘤，喉鱗狀細胞癌(LSCC)是該病主要的病理類型。目前研究認為喉癌是多種因素共同作用產生的結果，吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染、性激素是其主要危險因素，這些危險因素引起了機體組織細胞內癌癥相關因子的異常進而誘導腫瘤的發生〔1,2〕。miRNA是長度為23 nt左右的非編碼類RNA分子，且其能與靶基因mRNA 3′非翻譯區的的特異性相結合，并經過負性調控靶基因的轉錄表達，而參與到細胞增殖、凋亡、侵襲及遷徙等生物學的行為。因此其與多種疾病發生和發展緊密相關〔3,4〕。miR-126是一種位于表皮生長因子樣結構域7的第7個內含子內的miRNA，在癌癥中表達失調，并與腫瘤的血管生成、癌細胞增殖、侵襲、耐藥等過程密切相關。目前研究顯示miR-126在喉癌組織中低表達〔5,6〕，但具體機制未知，因此本研究分析miR-126對Hep2喉鱗狀細胞的遷移及侵襲能力產生的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 DMEM培養基和胎牛血清均從美國Gibco公司購入；檢測BCA蛋白濃度的試劑盒從南通碧云天生物公司購入；miR-126 mimics及miR-126 NC均從上海吉馬生物公司購入；兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、鋅指轉錄因子(Snail)、鋅指結合蛋白(ZEB)1蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT及甘油醛-3的磷酸脫氫酶(GAPDH)相關多克隆抗體從美國的Abcam公司購入；用于提取Trizol總RNA的試劑盒和LipofectamineTM3000脂質體及反轉錄的試劑盒均從大連寶生物公司購入。Applied Biosystems7500型PCR儀從美國的ABI公司購入；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度計從美國的Thermo公司購入；Epics-XLⅡ型流式細胞儀從美國的Beckman Coulter公司購入；ChemiDocTMXRS型凝膠成像系統從美國的伯樂公司購入。

1.2細胞培養 由中科院上海細胞庫提供細胞轉染喉鱗狀細胞癌的Hep2細胞。用無血清的Opti-MEM培養基對LipofectamineTM3000和miR-126 mimics(miR-126 mimics組)及miR-126 NC(miR-126 NC組)進行常規稀釋，將稀釋之后的LipofectamineTM3000同miRNA混勻，并在室溫的環境中放置約30 min，形成miRNA-LipofectamineTM3000的復合物。在肝癌細胞中加入復合物，并培養6 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加以10%的胎牛血清并培養48 h,使用Realtime-PCR法對細胞中miR-126的表達實施檢測。

1.3miR-126檢測 使用Realtime-PCR法對Hep2細胞中miR-126 的表達進行檢測，并收集細胞，使用Trizol法對細胞總RNA實施提取，采用光度計對RNA純度進行計測，若OD260nm/OD280nm=1.8時，則說明RNA的純度良好，且將RNA逆轉錄為cDNA，并將cDNA作為模板，放置于熒光定量PCR儀上施以檢測，將U6記作內參，計算出細胞內miR-126的相對表達量。

1.4細胞活力檢測 將Hep2細胞小心地平鋪于96孔板上，使用MTT法對細胞的活力進行檢測，并培養24 h，根據“1.2”轉染細胞培養48 h，48 h后加入MTT后繼續孵育4 h，然后去除上清液，同時每孔細胞中放入150 μl的二甲基亞砜，以溶解結晶物，在波長560 nm處對OD值進行測定。

1.5細胞遷移能力檢測 將轉染培養1 d后的細胞與transwell上室接種，且下室不予接種，加入10%的胎牛血清培養基，并培養48 h，48 h之后提取出小室。使用棉簽將上室細胞輕輕擦去，而下室細胞則采用多聚甲醛進行固定，使用1%的結晶紫對其染色，并放置于200倍的顯微鏡下，以觀察和計數穿越濾膜的有關細胞，計數后取平均值為細胞遷移的數目。

1.6transwell法檢測細胞侵襲能力 基質膠用DMEM培養液稀釋好，并平鋪于8 μm的transwell上室。將轉染1 d之后的有關細胞置于transwell上室內接種，且下室不予接種，加入10%的胎牛血清培養基，并培養48 h，而后提取出小室。使用棉簽將上室細胞輕輕擦去，而下室細胞則采用多聚甲醛進行固定，使用1%的結晶紫對其染色，并放置于200倍的顯微鏡下，以觀察和計數穿越濾膜的有關細胞，計數后取平均值為細胞遷移的數目。

1.7Western印跡法對細胞中蛋白表達進行檢驗 將轉染培養之后細胞的培養皿放置于冰上，接著刮下細胞，并將含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的液裂解細胞加入培養皿中，放置于4℃的環境中離心30 min，并收集其上清液。并對蛋白濃度的定量進行測定，樣品上樣之后，跑十二烷基苯磺酸鈉的凝膠電泳，且轉膜約30 min。加入5%脫脂奶粉后，在室溫的環境下孵育1 h，一抗在溶液4℃的環境下過夜孵育，次日在室溫的環境下孵育二抗，將化學發光的試劑加于膜上，在凝膠成像的系統中曝光，分析目的為蛋白條帶的灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-126 mimics轉染情況 Realtime PCR測定的結果顯示：miR-126 mimics組中miR-126的表達量(2.28±0.23)顯著高于miR-126 NC組(1.00±0.12，P<0.05)。

2.2miR-126對Hep2細胞活力和遷移能力及侵襲能力的作用 MTT實驗的結果顯示：miR-126 mimics組細胞活力為(0.38±0.04)，明顯低于miR-126 NC組(0.57±0.06，P<0.05)。transwell實驗結果表明：miR-126 mimics組〔(38.43±3.84)個〕細胞遷移數目顯著少于miR-126 NC組〔(158.68±15.87)個，P<0.05〕；miR-126 mimics組〔(44.29±4.43)個〕細胞侵襲數目顯著少于miR-126 NC組〔(199.36±18.40)個，P<0.05〕。見圖1、圖2。

圖1 miR-126對Hep2細胞遷移能力的影響(×200)

圖2 miR-126對Hep2細胞侵襲能力的影響(×200)

2.3miR-126對Hep2細胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表達的影響 Western印跡miR-126 mimics組MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表達量均顯著低于miR-126 NC組(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 miR-126對Hep2細胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1蛋白表達的影響

表1 miR-126對Hep2細胞中MMP2、MMP9、Snail、ZEB1、PI3K、p-Akt蛋白表達的影響

2.4miR-126對Hep2細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響 miR-126 mimics組PI3K、p-AKT蛋白表達量均顯著低于miR-126 NC組(P<0.05)。見表1、圖4。

圖4 miR-126對Hep2細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響

3 討 論

miR-126是從小鼠心臟和小腦中發現的一種位于表皮生長因子樣結構域7的第7個內含子內的miRNA，定位于人染色體9q34.3上。miR-126在內皮細胞中表達，miR-126在胚胎組織、消化系統、呼吸系統、生殖系統具有高度特異性，特別是對于心血管系統的特異性最高〔7～9〕。miR-126在心臟、肺等血管豐富的組織中高表達，而在大多數腫瘤組織中低表達，并與腫瘤的發生發展密切相關〔7～9〕。miR-126在腫瘤的診斷、預后等方面具有重要意義。目前研究顯示miR-126通過調控如趨化因子受體4、人類溶質載體家族7成員5等參與多種信號通路的調控作用〔7～9〕。魏梅等〔5〕研究表明miR-126的高表達可以提高男性喉癌患者的總生存率，這種作用可能是通過其靶基因調節細胞代謝及凋亡過程實現的。Sun等〔6〕研究證實miR-126在喉癌患者的血漿中表達量顯著下調，并與腫瘤的分化程度密切相關，而且通過抑制鈣調素調節蛋白抗體(Camsap)1表達參與喉癌的轉移。

本研究結果說明miRNA轉染成功。MTT實驗結果表明miR-126 mimics能顯著降低Hep2細胞活力,transwell實驗結果表明miR-126 mimics能顯著抑制Hep2細胞的遷移及侵襲能力，這些結果同在非小細胞肺癌的細胞〔10〕和膠質瘤細胞〔11〕中miR-126的作用是相同的，提示miR-126的過表達可以抑制Hep2的細胞活力、遷移及侵襲能力。腫瘤的侵襲轉移是喉癌患者術后預后不良的重要原因，因此抑制癌細胞的侵襲轉移對于預后的改善具有重要意義。MMPs是一種幾乎能夠降解細胞外基質所有成分的鋅依賴性內肽酶家族，在組織重構、血管生成、器官的發生發育、炎癥反應、細胞遷移等過程中發揮重要作用。Snail是近些年發現的一種定位于人染色體20q12.3的鋅轉錄因子，是上皮間充質轉分化(EMT)的關鍵蛋白，在胚胎發育、傷口愈合、細胞的遷移侵襲、EMT的發生過程中發揮著重要作用。ZEB蛋白為核轉錄因子，含有ZEB1和ZEB2。ZEB1位于機體10號染色體的短臂，可以對高達32種miRNA進行轉錄〔12,13〕。研究表明ZEB1是EMT中非常重要的調控因子，對EMT的發生有促進作用。本文結果顯示miR-126的過表達可以有效下調MMP2、MMP9、Snail、ZEB1的表達，可以對Hep2細胞的遷移及侵襲有效抑制。

PI3K/AKT信號通路別名為抗凋亡的信號通路，可以高度激活與多數的腫瘤組織中〔14,15〕。若PI3K被其上游生長的因子進行刺激后，可以使磷脂酰二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)3′羥基獲得磷酸化，同時轉化為三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，使AKT的結構出現變化，在絲氨酸/蘇氨酸的位點磷酸化，活化的AKT對下游靶蛋白的表達施以進一步的調控，并參與細胞增殖和血管生成、侵襲及遷移等生物學的行為〔14,15〕。因此本研究進一步探討miR-126對Hep2細胞中PI3K/AKT信號通路緊密相關蛋白的表達生成的影響，結果顯示miR-126過表達可以降低PI3K和p-AKT表達，進而對Hep2細胞的遷移及侵襲進行抑制。