miR-105-5p靶向THBS1調節神經炎癥和神經元凋亡參與阿爾茨海默病進展

鄭佳林 郭麗璇 金惠英 吳靜

(成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，四川 成都 610075)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的神經退行性疾病，研究表明抑制神經元的炎癥反應和凋亡是AD的潛在治療靶點〔1,2〕。目前已有研究發現，miRNA在AD患者的外周血中失調，可作為AD的候選生物標志物〔3,4〕。miR-105-5p在帕金森病患者及神經疾病患者血漿中異常上調，可作為帕金森病的潛在生物標志物〔5〕。然而，關于miR-105-5p在AD中的作用及下游機制未見研究。本研究旨在分析miR-105-5p對AD體外模型細胞增殖、凋亡和炎癥反應的影響，并進一步識別miR-105-5p的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12購自美國典型物保藏中心；10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養基、胰蛋白酶、Lipofectamin2000、TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher公司；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒購自中國碧云天公司；miR-105-5p模擬物(miR-105-5p mimic)及陰性對照(NC mimic)、miR-105-5p抑制劑(miR-105-5p inhibitor)及陰性對照(NC inhibitor)、THBS1過表達質粒(pc-THBS1)及陰性對照(pc-NC)均購自上海吉滿生物科技有限公司；Renilla-GloTM螢光素酶檢測系統購自美國Promega公司；anti-THBS1、anti-GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自上海艾博抗公司；MCO-18AC細胞培養箱均購自日本Panasonic公司；ABI-7300型熒光定量PCR儀均購自美國ABI公司；ST-360型全自動酶標儀購自上海科華醫療設備有限公司；DYCZ-25D型蛋白電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2細胞培養與分組 將PC12細胞培養于含10% FBS的RPMI-1640培養基中，并添加100 U/ml的青霉素連續培養至對數生長期。將對數生長期的PC12細胞使用胰蛋白酶消化并離心重懸，調整細胞密度為1×105/ml，接種于96孔板中培養至80%匯合。將PC12細胞分為對照組(正常培養狀態下的PC12細胞)、模型組〔25 μmol/L β-淀粉樣蛋白(Aβ25-35)誘導PC12細胞〕、NC inhibitor組(轉染NC inhibitor至模型組細胞)、miR-105-5p inhibitor組(轉染miR-105-5p inhibitor至模型組細胞)、NC mimic組(轉染NC mimic至模型組細胞)、miR-105-5p mimic組(轉染miR-105-5p mimic至模型組細胞)、miR-105-5p inhibitor+si-NC組(轉染si-NC和miR-105-5p inhibitor至模型組細胞)、miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組(轉染miR-105-5p inhibitor和si-THBS1至模型組細胞)。

1.3實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 收集各組細胞，在冰上裂解勻漿后Trizol試劑提取細胞總RNA。檢測純度后使用逆轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，在ABI-7300上進行qRT-PCR。以GAPDH和U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-105-5p和THBS1mRNA的相對表達量。各分子引物序列如下：miR-105-5p:正義鏈5′-TCGGCAGGTCAAATGCTCAGACTCC-3′,反義鏈5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；THBS1：正義鏈5′-AGACTCCGCATCGCAAAGG-3′,反義鏈5′-TCACCACGTTGTTGTCAAGGG-3′；GAPDH：正義鏈5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,反義鏈5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；U6：正義鏈5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′，反義鏈5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′。

1.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 使用ELISA試劑盒檢測各組轉染組中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β水平。將各組細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，收集各轉染組細胞培養上清液，根據制造商的說明，依次滴加一抗工作液、酶標抗體工作液、底物工作液及反應終止液，在450 nm處檢測各組吸光度值，根據標準曲線計算各組TNF-α及IL-1β水平。

1.5CCK-8實驗 將各轉染組細胞以5 000個/孔的密度接種于96孔板中，在細胞培養箱中繼續培養。分別在第24 h、48 h和72 h時，向每孔中滴加10 μl的CCK-8試劑。37℃下孵育1 h后，在酶標儀上分別測量各組細胞吸光度值(OD=450 nm)。

1.6流式細胞術 使用胰酶消化細胞，收集細胞接種于6孔板后繼續培養24 h，棄去上清液。根據AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明：使用4℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，1×結合緩沖液重懸細胞，在細胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI，避光環境下室溫孵育15 min，并在1 h內用流式細胞儀檢測各組PC12細胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告實驗 通過StarBase數據庫預測可能與miR-105-5p結合的靶基因，以THBS1為研究對象。使用Lipofectamine2000將THBS1-WT或THBS1-MUT與NC mimic或miR-105-5p mimic共轉染至PC12細胞中，轉染48h后分析各組熒光素酶活性。

1.8Western印跡 使用RIPA裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂牛奶封閉。與適當稀釋的一抗(anti-THBS1)和anti-GAPDH在4℃下孵育過夜，次日取出TBST洗膜后與HRP標記的二抗工作液在室溫下孵育1 h。電化學發光(ECL)試劑顯色成像，Image J計算灰度值。

1.9統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1各組miR-105-5p和THBS1表達水平比較 與對照組miR-105-5p的表達水平(1.011±0.127)相比，模型組(1.731±0.070)顯著上調(P<0.05)，與對照組THBS1的表達水平(1.000±0.081)相比，模型組(0.470±0.161)顯著下調(P<0.05)。

2.2兩組TNF-α、IL-1β水平比較 與對照組相比，模型組TNF-α和IL-1β水平均顯著升高；與NC inhibitor組相比，miR-105-5p inhibitor組TNF-α和IL-1β水平均顯著下降(均P<0.05)，見表1。

2.3各組細胞凋亡率及細胞活力比較 與對照組細胞的凋亡率相比，模型組顯著升高(P<0.05)，與NC inhibitor組細胞凋亡率相比，miR-105-5p inhibitor組顯著下降(P<0.05)。轉染48 h后，與對照組細胞活力相比，模型組顯著降低(P<0.05)與NC inhibitor組細胞活力相比，miR-105-5p inhibitor組顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

表1 各組TNF-α、IL-1β、細胞凋亡率、細胞活力比較

2.4miR-105-5p和THBS1的靶向結合關系 通過在線數據庫StarBase預測到miR-105-5p與THBS13′UTR之間存在結合位點。THBS1-WT+NC mimic組與THBS1-WT+miR-105-5p mimic組的熒光素酶活性分別為1.02±0.11與0.72±0.07，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，THBS1-MUT+NC mimic組與THBS1-MUT+miR-105-5p組熒光素酶活性分別為1.03±0.10與0.91±0.09，組間差異無統計學意義(P>0.05)；與NC mimic組THBS1蛋白水平(1.06±0.14)相比，miR-105-5p的過表達(0.23±0.04)可顯著降低THBS1在AD細胞模型中的蛋白水平(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-105-5p靶基因的預測及過表達miR-326對THBS1蛋白水平的影響

2.5下調miR-105-5p和THBS1對AD模型細胞中炎癥因子的影響 miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組TNF-α及IL-1β水平顯著高于miR-105-5p inhibitor+si-NC組(P<0.05)，見表3。

2.6下調miR-105-5p和THBS1對AD模型細胞增殖和凋亡的影響 與miR-105-5p inhibitor+si-NC組相比，miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，轉染48 h后，miR-105-5p inhibitor+si-THBS1組細胞活力顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表3 轉染miR-105-5p inhibitor和si-THBS1對細胞中炎癥因子水平、細胞增殖、細胞凋亡率的影響

3 討 論

miRNA被證實可通過調控AD中相關生物標志物參與AD進展〔6〕。有研究表明miR-105-5p可在非小細胞肺癌細胞和膠質瘤細胞中發揮促凋亡作用并抑制癌細胞的惡性進展〔7,8〕。THBS1可與包括細胞受體、生長因子、細胞因子及蛋白酶在內的多種配體相互作用，從而調節各種生理和病理過程〔9,10〕。有研究表明，THBS1可通過維持線粒體動力學和線粒體功能的平衡，調控神經元細胞活性，是AD的潛在治療靶點〔11〕。本研究實驗結果提示miR-105-5p可調控AD模型細胞中的炎性介質的釋放、細胞增殖與凋亡。