四君子湯對結腸癌小鼠腸道菌群及免疫功能的調節作用

歐陽慶武 費雁 魏運姣 段青

(武漢市第四醫院 1綜合病房；湖北 武漢 430000；2腫瘤科)

結腸癌是世界第3大惡性腫瘤，其發病率和死亡率因人們飲食結構、所處環境、生活方式的不同而存在差異；據統計，每年約有120萬患者被診斷為結腸癌，超過60萬患者因結腸癌死亡〔1，2〕。我國國家中央癌癥登記處數據顯示：結腸癌患者中男性多于女性，城市人口多于農村，2011年約有15萬結腸癌患者死亡，并且其發病率和死亡率呈上升趨勢〔3〕。結腸癌的發生是遺傳多態性與多種不良因素共同作用的結果，有研究表明，腸道菌群失衡會通過不同形式導致癌癥的發生〔4〕。化療、外科手術治療是結腸癌主要治療方式，雖然術后輔助化療在一定程度上降低了腫瘤復發的風險，但其對患者毒副作用較大〔5〕，尋找高效低毒的治療方式具有重要意義。

傳統中醫藥治療具有悠久的臨床應用歷史，因其毒副作用小、來源于天然藥物而受到廣泛重視。隨著對中醫藥療法的不斷研究，學者發現中醫藥輔助結腸癌的治療有助于改善患者身體免疫功能及預后，取得顯著療效〔6〕。四君子湯由人參、白術、茯苓、甘草4味中草藥組成，具有補氣、益氣、健脾的功效，可通過免疫分子、免疫細胞、免疫器官、胃腸道調節機體免疫功能〔7〕。此外，四君子湯具有抗腫瘤、抗疲勞、耐氧、修復肝臟等作用，常用于癌癥的輔助治療〔8〕。本文以四君子湯灌胃結腸癌模型小鼠，以研究四君子湯對小鼠腸道菌群、免疫功能及移植瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華公司；人參、白術、茯苓、甘草購自同仁堂大藥房；CT26結腸癌細胞(批號：CRL-2638)購自ATCC細胞庫；胎牛血清(批號：10099-141)、DMEM培養基(批號：31053028)、胰蛋白酶(批號：20230)購自賽默飛世爾科技有限公司；4%多聚甲醛(批號：P1110)、免疫球蛋白(Ig)G酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：SEKS-0034)、IgA ELISA試劑盒(批號：SEKB-0002)、IgM ELISA試劑盒(批號：SEKS-0035)購自北京Solarbio公司；ACK紅細胞裂解液(批號：CS0001)購自北京雷根生物技術有限公司；瑞氏染色液(批號：HB8286)購自青島海博生物技術有限公司；德國偉力真空泵視油鏡購自東莞捷勝真空機械設備有限公司；細胞培養箱購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自Miltenyi Biofec公司。

1.2動物模型制造及分組 將60只BALB/c小鼠適應性飼養7 d，隨機選取10只設為對照組，50只設為模型組。對照組：正常飼養不做任何處理；模型建立：按照郭亞榮等〔9〕的方法，運用氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠結腸癌模型；將造模小鼠隨機分為5組每組10只，分別設為：模型組，四君子湯0.125 ml(低劑量組)、四君子湯0.250 ml(中劑量組)、四君子湯0.500 ml(高劑量組)、模型+陰性對照組。從中篩選最適濃度(四君子湯0.5 ml)標記為四君子湯組。四君子湯給藥方法：以四君子湯水煎劑0.125、0.250、0.500 ml/次(1 g生藥/ml)進行灌胃，2次/d，連續灌胃7 d；模型+陰性對照組以無菌生理鹽水代替四君子湯行灌胃處理。模型組和對照組進行正常飼養，不做任何處理。第8天對所有實驗小鼠進行眼眶靜脈采血、斷頸法處死小鼠、小心摘取腫瘤、脾臟和腎臟并稱重、無菌采取盲腸內容物0.1 g，均置于-20℃保存備用。

1.3小鼠腸道菌群檢測 腸道菌群中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、腸桿菌的含量檢測參考吳秀等〔10〕的方法，將盲腸內容物樣品無菌條件下恢復至室溫，放入無菌離心管中，加入生理鹽水進行梯度稀釋(10-1、10-2、10-3)；取3個稀釋度的樣品各10 μl均勻涂布于選擇性培養基上，倒置于35℃ 恒溫培養箱中，腸桿菌需氧培養24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌厭氧培養48 h，觀察計數。結果按照菌落形成單位/g的對數(logCFU/g)表示。

1.4主要免疫器官指數 稱量剝離的小鼠脾臟、胸腺、瘤體重量，測量瘤體最長徑和最短徑，計算脾和胸腺指數及瘤體體積。計算公式：指數(mg/g)= 免疫器官質量(mg)/體重(g)；瘤體體積(mm3)=(π×瘤體最長徑×最短徑2)/6。

1.5小鼠血清IgG、IgA、IgM水平檢測 將麻醉后的小鼠腹部向上固定在操作臺上，剪開皮膚，暴露腹腔。手持穿刺針30°斜向下刺入主動脈，抽取血液，用離心半徑10 cm的離心機447 r/min離心15 min，收集血清，-20℃ 保存。ELISA檢測小鼠血清中IgG、IgA、IgM水平。

1.6小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+水平檢測 取100 μl小鼠全血，加入含相應抗體的EP管中，4℃ 暗室孵育30 min，加入紅細胞裂解液，混勻后避光靜置10 min，加入500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，離心棄上清。2%多聚甲醛固定，流式細胞儀分析T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+比例。

1.7巨噬細胞吞噬功能檢測 處死小鼠前30 min將1%雞紅細胞(CRBC)懸液0.5 ml注入小鼠腹腔，輕輕揉腹。處死小鼠后取腹腔液涂片，自然風干后瑞氏染色，使用油鏡隨機觀察100個巨噬細胞。吞噬百分率 =(吞噬CRBC的巨噬細胞數/100)×100%；吞噬指數= 吞噬細胞吞噬的CRBC數/100。

1.8統計學分析 使用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1四君子湯對結腸癌模型小鼠腸道菌群的影響 與對照組相比，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌水平顯著降低(P<0.05)，腸球菌、腸桿菌水平顯著升高(P<0.05)；經用四君子湯治療后，小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、腸桿菌4種菌群基本恢復至正常水平，與模型+陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。且高劑量組作用最顯著，故選用0.5 ml用作后續實驗。

表1 四君子湯對結腸癌模型小鼠腸道菌群的影響

2.2四君子湯對結腸癌模型小鼠主要免疫器官臟指數的影響 模型組脾、胸腺指數較對照組顯著降低(P<0.05)；而經四君子湯灌胃治療后，脾和胸腺指數在一定程度上顯著提升(P<0.05)，接近正常水平。見表2。

表2 四君子湯對結腸癌模型小鼠主要免疫器官指數的影響

2.3四君子湯對結腸癌模型小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響 模型組巨噬細胞吞噬率和吞噬指數較對照組顯著下降(P<0.05)；高劑量組巨噬細胞吞噬率和吞噬指數與模型+陰性對照組比顯著回升(P<0.05)，接近正常水平。見表3。

表3 四君子湯對結腸癌模型小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

2.4四君子湯對結腸癌模型小鼠血清IgG、IgA、IgM水平的影響 與對照組相比，模型組血清IgG、IgA、IgM水平顯著降低(P<0.05)；而經四君子湯灌胃治療后，與模型+陰性對照組比較血清IgG、IgA、IgM水平顯著升高，基本回升至正常水平(P<0.05)。見表4。

表4 四君子湯對結腸癌模型小鼠血清IgA、IgA、IgM水平及外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+水平的影響

2.5四君子湯對結腸癌模型小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+水平的影響 與對照組比較，模型組血清CD3+、CD4+水平降低(P<0.05)，CD8+水平升高(P<0.05)，CD4+/CD8+比值下降(P<0.05)；而經四君子湯治療后，小鼠血清CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值基本恢復至正常水平，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 細胞流式圖

2.6四君子湯對結腸癌模型小鼠瘤體質量和體積的影響 經四君子湯治療小鼠體內瘤體質量和體積均小于模型+陰性對照組(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 四君子湯對結腸癌模型小鼠瘤體質量和體積的影響

圖2 四君子湯對結腸癌模型小鼠瘤體的影響

3 討 論

結腸癌的發生可能與年齡、飲食、肥胖、飲酒等因素有關，其中，腸道菌群穩態的失衡被認為能夠直接誘發結腸癌〔11，12〕。人體腸道菌群是一個復雜的微生態系統，包括大量類桿菌、雙歧桿菌、消化球菌等專性厭氧菌，其中雙歧桿菌和類桿菌占90%以上，少量為腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌等〔13〕。腸道微生物群在腸道結構、免疫及代謝作用中起重要作用，通過其代謝物如酚類化合物、胺類、亞硝基化合物、CO2等參與碳水化合物、蛋白的水解發酵，從而影響腸上皮細胞增殖和分化〔14〕。腸道微生物組成的改變可能有利于致癌細菌的滋生，影響結腸癌相關的微環境〔15〕。此外，研究發現：大腸桿菌可產生細胞致死膨脹毒素，誘導核轉錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子α、白介素6等促炎因子產生，從而促進結腸癌發展〔16，17〕；而雙歧桿菌、乳酸桿菌能夠誘導CD4+T細胞分化為調節性T細胞，增加調節性T細胞豐度；誘導IgA產生(IgA是腸道黏膜發揮免疫功能的重要分子)，抑制結腸癌的發生〔18，19〕。已有證據〔20〕表明：腸道微生物組成平衡的失調通過誘導炎癥或免疫反應而引發結腸癌。

傳統中醫藥能夠調節機體免疫功能，其藥效發揮與腸道微生物組成密切相關。據報道〔21，22〕，黨參、白術、山藥、黃芪等健脾中藥能夠促進雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌生長，調節腸道蠕動功能，使腸道菌群穩態保持平衡；補中益氣湯可顯著提高小鼠血清CD4+/CD8+比值，促進淋巴細胞轉化，增強小鼠體細胞免疫功能。四君子湯是治療脾胃氣虛的經典方，其水煎劑包含多糖、皂苷類、黃酮類等化學成分。Yu等〔23〕研究發現，四君子湯能夠降低腸道黏膜CD3+、CD8+T細胞含量并提高CD4+T細胞水平，從而調節適應性免疫應答。在腫瘤的相關研究中，已有文獻報道稱：四君子湯能夠通過調節T淋巴細胞和自然殺傷細胞降低肝癌患者術后復發率〔24〕，并且通過調節細胞凋亡相關蛋白、促進細胞色素C釋放從而激活半胱氨酸蛋白酶3介導的細胞凋亡途徑，誘導甲狀腺癌細胞凋亡，發揮抑癌作用〔25〕。此外，已有研究表明：四君子湯可作為臨床常用化療藥物氟尿嘧啶(5-FU)的增效劑，增強5-FU對結腸癌細胞生長的抑制作用。

綜上所述，四君子湯能夠維持腸道微生態平衡，通過調節免疫球蛋白和T淋巴細胞亞群提高機體免疫力，抑制小鼠體內腫瘤的生長；本研究結果為臨床上應用四君子湯輔助治療結腸癌提供了一定的理論依據。