槲皮素調控p53表達對胃癌細胞惡性行為的作用

邵延萱 羅文哲 張輝

(佳木斯大學 1臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；2基礎醫學院)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，2018年的一項研究表明，全球胃癌的新發病例約為100萬例，死亡人數亦達到7.83萬例，分別位列所有惡性腫瘤的第五位和第三位〔1～3〕。

槲皮素又稱槲皮黃素，是一種廣泛存在于多種蔬菜和水果中的天然醇羥基黃酮類化合物，其在紅洋蔥、石榴、藕、紅提和芒果等食物中含量居多〔4〕。作為一種重要的多酚化合物，槲皮素具有廣泛的生物學和藥物學功效，主要包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老、降糖和保護心血管等作用〔5〕。已有大量研究證實，槲皮素可經不同的信號通路顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，并誘導腫瘤細胞凋亡〔6～9〕。如一項有關肺癌的研究報道，不同濃度的槲皮素均可顯著抑制A549、H1299和H460腫瘤細胞的活性，并誘導這些細胞發生凋亡，且該作用與其上調腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員6(FAS)、TNFR1等細胞死亡和凋亡相關通路基因和下調核因子(NF)-κB、蛋白激酶B(AKT)等細胞存活相關通路基因的表達有關〔10〕。本實驗通過研究不同濃度槲皮素對胃癌細胞增殖和遷移能力的影響，探討和明確槲皮素治療胃癌的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1主要實驗用細胞、試劑、材料及儀器 SCG7901人胃癌細胞系購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；槲皮素購自金穗生物公司；RPMI1640細胞培養基和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、細胞培養瓶、細胞培養皿、離心管和Transwell細胞小室購自美國Corning公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、30%丙烯酰胺單體貯液、青鏈霉素雙抗購自碧云天生物技術公司；細胞計數試劑盒(CCK)-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；彩色預染蛋白質分子量標準購自北京索萊寶科技有限公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑購自北京百奧萊博科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Milipore公司；鼠抗p53單克隆抗體購自美國Abways公司；鼠抗β-肌動蛋白(actin)單克隆抗體購自北京中杉金橋公司；增強化學發光(ECL)試劑購自美國Thermo Fisher公司；cDNA第一鏈合成試劑盒和熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；全自動化學發光圖像采集及分析系統購自上海天能公司；電泳儀、電泳槽和轉膜槽購自北京六一生物科技有限公司；二氧化碳培養箱和全自動多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置光學顯微鏡購自德國蔡司公司；高速冷凍離心機購自德國貝克曼公司。

1.2細胞培養及分組 將SCG7901人胃癌細胞進行復蘇后接種于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養基中，置于37℃含5%CO2的飽和濕度培養箱中傳代培養。待細胞處于對數生長期后，對細胞進行消化、計數和分組，并將各組細胞分別重懸于含槲皮素的RPMI1640完全培養基中，對照組和槲皮素組培養基中的槲皮素終濃度分別為0、20、40和60 μmol/L。

1.3細胞增殖 將處于對數生長期的SCG7901人胃癌細胞培養于96孔板的各孔中，每孔接種的細胞數為2×103個；將培養孔中的細胞隨機分為對照組和槲皮素組，每組設5個復孔，各組細胞分別用含終濃度為0、20、40和60 μmol/L 槲皮素的100 μl RPMI1640完全培養基培養(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；在細胞于37℃含5% CO2的飽和濕度培養箱中培養24、48、72 h的各時間點上，分別棄除培養基，并向各孔中加入110 μl含10% CCK-8試劑的完全培養基；隨后將細胞培養孔板繼續在培養箱中孵育2 h；最后利用酶標儀讀取各孔板培養基在450 nm波長處的吸光度值，該值反映細胞活性和增殖情況。

1.4細胞遷移 將處于對數生長期的SCG7901人胃癌細胞分為對照組和槲皮素組，將2×104個細胞重置于100 μl培養基中接種于每個transwell上室中，各組所用的培養基分別為含終濃度為0、20、40、60 μmol/L槲皮素的無FBS RPMI1640培養基；各組transwell下室中為600 μl含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素RPMI1640完全培養基；將transwell單元在37℃含5% CO2的飽和濕度培養箱中培養48 h；取出transwell單元，用醫用棉簽小心擦拭掉上室上表面未遷移的細胞；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，將上室置于70%的乙醇固定液中于室溫環境下對細胞進行固定30 min；用0.5%結晶紫染液于室溫環境下對遷移細胞進行染色；自來水沖洗、晾干后，將tranwell遷移膜在顯微鏡下觀察、拍照和計數，每個膜隨機選擇5個視野的數據進行統計分析。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 將細胞進行常規提取總RAN和定量后，合成cDNA第一鏈，利用熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR并同時描繪標準曲線。應用融解曲線對各樣本的目的基因產物、非特異產物和引物二聚體進行區分。分別計算目的基因p53和內參基因β-actin的Ct值，應用2-ΔΔCt法對p53的mRNA表達量進行計算，公式為：ΔCt=Ct(p53)-Ct(β-actin)。

1.6Western印跡 將處于對數生長期的SCG7901人胃癌細胞培養于6孔板的各孔中，每孔接種的細胞數為1×106個；將培養孔中的細胞隨機分為對照組和槲皮素組，各組培養基分別為1 ml含終濃度為0、20、40和60 μmol/L槲皮素的RPMI1640完全培養基(含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)；細胞在37℃含5% CO2的飽和濕度培養箱中培養72 h，棄除培養基后，用PBS清洗3次；向每孔中加入200 μl含1% PMSF的RIPA蛋白裂解液；劇烈吹打裂解細胞后，將細胞裂解液轉移入離心管中；在4℃環境下將離心管于高速離心中機離心20 min(15 000 r /min)；吸取上清液并利用BCA蛋白定量試劑盒測定裂解液中各樣本蛋白濃度；配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠；分別將30 μg各組樣本總蛋白加入不同凝膠泳道中進行垂直電泳；利用濕轉法將蛋白轉印到PVDF膜，并用5%脫脂奶封閉液進行室溫封閉1 h；PBS-吐溫(T)清洗3次后，將轉印膜分別置于p53(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)抗體稀釋液中，并在4℃冰箱中撫育過夜；次日，PBS-T清洗3次后，將轉印膜置于HRP標記的二抗稀釋液中，并在37℃中孵育30 min；PBS-T清洗3次后，利用ECL和全自動化學發光圖像采集及分析系統對目的蛋白條帶進行顯影并測定光密度值，以β-actin作為內參對目的蛋白進行半定量。

1.7統計學分析 采用SPSS17.0 統計軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1槲皮素抑制SCG7901人胃癌細胞的增殖能力 細胞培養24 h后，CCK-8實驗表明，與對照組比較，40、60 μmol/L槲皮素組細胞的增殖能力顯著降低；在48和72 h后，20、40、60 μmol/L槲皮素組細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05;P<0.01)。見表1。

表1 不同濃度槲皮素不同培養時間影響SCG7901細胞增殖能力

2.2槲皮素抑制SCG7901人胃癌細胞的遷移能力 細胞培養24 h后，0、20、40、60 μmol/L槲皮素組細胞的遷移數分別為(356.00±26.99)個、(310.00±25.06)個、(261.20±19.08)個和(212.80±10.92)個。與對照組比較，20、40、60 μmol/L槲皮素組遷移細胞數量顯著降低(P<0.01)。40 μmol/L槲皮素組遷移細胞數顯著低于20 μmol/L槲皮素組(P<0.05)，60 μmol/L槲皮素組遷移細胞數顯著低于40 μmol/L槲皮素組(P<0.01)。可見，槲皮素抑制SCG7901細胞遷移能力具有劑量依賴性。

2.3槲皮素上調SCG7901人胃癌細胞p53 mRNA和蛋白表達 實時熒光定量PCR結果表明，槲皮素處理SCG7901細胞后，與對照組相比，24 h后，60 μmol/L槲皮素組細胞p53 mRNA和蛋白表達水平顯著增高，48和72 h后各濃度槲皮素組的p53 mRNA和蛋白表達水平均顯著增高(P<0.05；P<0.01)。見表2、3。

表2 培養不同時間不同濃度槲皮素影響SCG7901細胞p53 mRNA表達

表3 不同濃度槲皮素影響SCG7901細胞p53 蛋白表達

3 討 論

研究已證實，槲皮素對人體多種腫瘤細胞均具有抑癌活性，包括促進腫瘤細胞的凋亡、抑制腫瘤細胞的生長、增殖、轉移和侵襲等〔11〕。與以往研究結果相似，本研究表明不同濃度的槲皮素可顯著抑制人SCG7901胃癌細胞的增殖和遷移能力，且槲皮素可在mRNA和蛋白水平上調SCG7901細胞腫瘤抑制基因p53的表達。

p53是一個與人類多種腫瘤發生、發展密切相關的重要基因，它位于染色體17p13，包括突變型和野生型兩類〔12〕。功能研究證實，p53基因可通過形成一個四聚體轉錄因子，進而抑制和(或)活化下游目標基因來發揮生物學作用，這些作用涉及細胞分化、凋亡、免疫應答、癌癥發生、細胞周期調節和DNA功能等多個方面〔13〕。目前認為，野生型p53是一種腫瘤抑制基因，而突變型p53則具有促進細胞惡性轉化的能力〔12〕。研究證實，當細胞發生應激損傷時(如DNA損傷)，野生型p53可精確控制細胞周期并誘導發生損傷的細胞以凋亡形式死亡〔14〕。野生型p53對細胞凋亡的影響與其通過與促凋亡基因Bax啟動子區發生特異性結合來轉錄激活Bax基因有關〔15〕。野生型p53對細胞周期的調控主要是通過誘導激活其下游產物p21，進而抑制細胞周期素依賴激酶(CDK)的轉錄，使細胞周期阻滯于G1期〔16〕。此外，研究顯示野生型p53還可激活細胞衰老相關信號通路，在抗腫瘤藥物奧沙利鉑治療大腸癌中發揮重要作用〔17〕。然而，當p53基因發生突變或損傷后，可產生突變型p53，后者可促進受損DNA發生凝聚，結果會使細胞發生異常轉化甚至發展為腫瘤〔14〕。實驗表明，在不同的腫瘤組織中，p53基因均可發生不同程度的突變，且其在胃癌和胰腺癌等消化系統腫瘤中的突變率可達50%左右〔18〕。此外，研究證實p53基因在子宮頸癌患者中突變率也高達50%～65%，且突變型p53陽性且強表達的癌組織侵襲能力更強〔14，19〕。

大量研究已證實p53基因在槲皮素發揮抗腫瘤活性中具有重要作用〔20～23〕。如在宮頸癌的一項研究中發現，槲皮素可誘導HeLa和SiHa細胞G2期阻滯和細胞凋亡，增加p53下游兩個效應物p21基因的轉錄和促凋亡Bax蛋白的水平，同時還發現伴有p53及其核信號的增加〔23〕。綜上，槲皮素可顯著抑制SCG7901胃癌細胞的增殖和遷移能力，該機制是通過其活化和上調p53腫瘤抑制基因，并進而影響腫瘤惡性進程得以實現的。