過(guò)表達(dá)LINC00595降低前列腺癌細(xì)胞PC3對(duì)多西他賽的耐藥性

邢增術(shù) 李賽蓮 禹剛 邢健生 王國(guó)任 劉振湘

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 1泌尿外科，海南 ?？?570208；2消化內(nèi)科)

前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤〔1，2〕。目前，晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的一線治療仍是內(nèi)分泌治療〔3，4〕?；颊咭坏┻M(jìn)入去勢(shì)抵抗前列腺癌期，其預(yù)后一般較差。自2004年美國(guó)FDA批準(zhǔn)多西他賽(DTX)治療去勢(shì)抵抗前列腺癌期以來(lái)，已被證明能有效延長(zhǎng)去勢(shì)抵抗前列腺癌期患者的總生存時(shí)間，但大多數(shù)患者最終對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性〔5〕。因此，研究去勢(shì)抵抗前列腺癌對(duì)DTX耐藥的分子機(jī)制對(duì)于探索新的診斷生物標(biāo)志物和新型有效的治療策略十分必要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一種大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在表觀、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)〔6〕。已有研究表明LncRNAs參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，LncRNAs具有作為人類(lèi)癌癥診斷和治療生物標(biāo)志物的作用〔7〕。此外，某些LncRNAs的異常表達(dá)可能調(diào)控包括前列腺癌在內(nèi)的多種癌癥的化療耐藥性〔8〕。LINC00595是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，目前尚無(wú)LINC00595參與前列腺癌細(xì)胞對(duì)DTX耐藥調(diào)控的有關(guān)報(bào)道。PC3細(xì)胞系是從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來(lái)的細(xì)胞，其分化程度低，為雄激素非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞，不具有內(nèi)源性的雄激素受體，具有中等強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移潛能，被廣泛用于雄激素抵抗型前列腺癌的研究〔9〕。本研究探討LINC00595對(duì)前列腺癌PC3 DTX耐藥細(xì)胞增殖、凋亡及酪氨酸激酶受體(Trk)B表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人前列腺癌PC3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)和Docetaxel購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol和Lipofectamine 2000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit購(gòu)自大連寶生生物公司；MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司；LINC00595過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(ov-LINC00595)和對(duì)照質(zhì)粒(ov-NC)均購(gòu)自廣州萊德聯(lián)康生物公司；ABI Prism?快速7500型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；BD Calibur flow cytometer購(gòu)自美國(guó)BD公司；倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2)購(gòu)自日本OLYMPUS公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和DTX耐藥處理 人前列腺癌PC3細(xì)胞系采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，并在37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用DMSO將DTX溶解配制成母液，然后按照先前報(bào)道的間歇逐步增加劑量法〔10〕將DTX添加于培養(yǎng)基中誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系PC3的DTX(PC3-DTX)耐藥性。PC3細(xì)胞先依次在含有4、8、12 nmol/L的DTX中培養(yǎng)3 w。隨后將存活的細(xì)胞重新傳代于新的DEME中培養(yǎng)2 w，接著用10 nmol/L的DTX開(kāi)始處理，隨后逐漸增加5 nmol/L，最終劑量為50 nmol/L。含DTX的培養(yǎng)基每2～3 d更換1次。最后將PC3-DTX細(xì)胞在40 nmol/L的PC3-DTX培養(yǎng)維持1個(gè)月。

PC3-DTX細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，包括LINC00595過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(ov-LINC00595)和對(duì)照質(zhì)粒(ov-NC)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3RT-qPCR檢測(cè)LINC00595 和TrkB mRNA的表達(dá) 收集經(jīng)培養(yǎng)或處理后的前列腺癌PC3細(xì)胞或PC3-DTX細(xì)胞，Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR檢測(cè)細(xì)胞中LINC00595和TrkB mRNA表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00595和TrkB相對(duì)表達(dá)。

1.4MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖 MTS法檢測(cè)PC3細(xì)胞和PC3-DTX細(xì)胞的增殖，并計(jì)算PC3細(xì)胞和PC3-DTX細(xì)胞的IC50值。將PC3細(xì)胞和PC3-DTX細(xì)胞在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入不同濃度的DTX(10、50、100、200、400、800 nmol/L)，并設(shè)置不加細(xì)胞液的對(duì)照孔，每種處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖，酶標(biāo)儀上測(cè)定細(xì)胞在490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞對(duì)DTX的抑制濃度值(IC50)。MTS法檢測(cè)PC3-DTX細(xì)胞增殖，將正常培養(yǎng)的PC3-DTX細(xì)胞(空白組)、轉(zhuǎn)染LINC00595過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(ov-LINC00595)和對(duì)照質(zhì)粒(ov-NC)后的PC3-DTX細(xì)胞接種至96孔板中，隨后按照MTS檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)0、24、48、72 h后，酶標(biāo)儀上測(cè)定細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.5克隆形成分析檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 將正常培養(yǎng)的PC3-DTX細(xì)胞(空白組)、轉(zhuǎn)染LINC00595過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(ov-LINC00595)和對(duì)照質(zhì)粒(ov-NC)后的PC3-DTX細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)14 d后吸去培養(yǎng)液并用PBS洗滌細(xì)胞，隨后甲醛固定細(xì)胞，最后用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)克隆形成情況。

1.6流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的周期和凋亡 將正常培養(yǎng)的PC3-DTX細(xì)胞(空白組)、轉(zhuǎn)染LINC00595過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(ov-LINC00595)和對(duì)照質(zhì)粒(ov-NC)的PC3-DTX細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)在BD的流式細(xì)胞儀上對(duì)細(xì)胞周期和凋亡進(jìn)和檢測(cè)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PC3-DTX細(xì)胞的耐藥性 細(xì)胞耐藥增殖結(jié)果顯示，PC3-DTX細(xì)胞組對(duì)DTX的IC50值顯著高于正常培養(yǎng)的PC3細(xì)胞組(P<0.001)。表明PC3-DTX耐藥株構(gòu)建成功。見(jiàn)表1。

2.2LINC00595及TrkB在PC3-DTX細(xì)胞中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的PC3細(xì)胞組相比，PC3-DTX細(xì)胞組中LINC00595相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而TrKB相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 PC3-DTX細(xì)胞耐藥性及LINC00595、TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)水平

2.3PC3-DTX細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)LINC00595 PC3-DTX細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后，與ov-NC組相比，ov-LINC00595組的PC3-DTX細(xì)胞中LINC00595相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.4過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞增殖的影響 MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ov-NC組相比，經(jīng)培養(yǎng)48和72 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ov-LINC00595組細(xì)胞的吸光度值顯著下降，其中培養(yǎng)72 h后表現(xiàn)最顯著(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PC3-DTX細(xì)胞中LINC00595表達(dá)水平及轉(zhuǎn)染ov-LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞增殖的影響

2.5過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞周期的影響 與轉(zhuǎn)染ov-NC組相比，轉(zhuǎn)染ov-LINC00595組的PC3-DTX細(xì)胞中S期的細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，而G2期的細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)圖1和表3。

表3 過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞周期的影響

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC3-DTX細(xì)胞周期

2.6過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞凋亡及細(xì)胞克隆形成的影響 與轉(zhuǎn)染ov-NC組相比，轉(zhuǎn)染ov-LINC00595組的PC3-DTX細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例顯著增加，而克隆形成細(xì)胞數(shù)目顯著減少(均P<0.001)。見(jiàn)表4、圖2、圖3。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC3-DTX細(xì)胞凋亡

圖3 結(jié)晶紫染色檢測(cè)PC3-DTX細(xì)胞克隆形成(×200)

2.7過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞中TrkB mRNA表達(dá)的影響 PC3-DTX細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后，與轉(zhuǎn)染ov-NC組相比，轉(zhuǎn)染ov-LINC00595的PC3-DTX細(xì)胞中TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著減少(P<0.001)。見(jiàn)表4。

表4 過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞凋亡、細(xì)胞克隆形成及TrkB mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

DTX是紫杉烷衍生的具有抗細(xì)胞有絲分裂的藥物，被認(rèn)為是臨床治療前列腺癌的一種有效的化療藥物，而大多數(shù)前列腺癌患者最終會(huì)產(chǎn)生DTX耐藥性，使得其化療效果不再有效，患者不得不被動(dòng)面對(duì)腫瘤惡化甚至死亡〔11〕。探索其耐藥機(jī)制對(duì)前列腺癌患者預(yù)后具有重要的臨床意義。

研究表明，有些LncRNAs失調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多腫瘤發(fā)生發(fā)展，而有些LncRNAs會(huì)影響腫瘤對(duì)DTX的化療敏感性〔12，13〕。如LncRNA DANCR在DTX耐藥前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，沉默LncRNA DANCR表達(dá)通過(guò)靶向調(diào)控miR-34a-5p/JAG1途徑增強(qiáng)DTX耐藥前列腺癌細(xì)胞對(duì)DTX的敏感性〔14〕。Gao等〔15〕研究表明，LncRNA癌易感性侯選基因(CASC)2在前列腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)均下調(diào)，LncRNA CASC2過(guò)表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性。LINC00595作為一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，Riege等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)LINC00595在真菌和細(xì)菌感染中具有刺激特異性免疫調(diào)節(jié)活性的LncRNA標(biāo)記基因的特性。而LINC00595在DTX耐藥中的作用未見(jiàn)報(bào)道，其作用也尚不清楚。本研究通過(guò)建立人DTX耐藥細(xì)胞系和PC3-DTX作為體外細(xì)胞模型，結(jié)果表明體外PC3-DTX細(xì)胞模型構(gòu)建成功，提示LINC00595在PC3-DTX細(xì)胞中異常表達(dá)，可能在PC3細(xì)胞的耐藥中發(fā)揮重要作用。研究表明，有一小部分(約3%)的LncRNA在腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)〔17〕。細(xì)胞過(guò)度增殖是腫瘤發(fā)展的重要特性。本研究提示過(guò)表達(dá)LINC00595對(duì)PC3-DTX細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用。此外，表明過(guò)表達(dá)LINC00595抑制PC3-DTX細(xì)胞增殖可能與其抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在PC3-DTX細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LINC00595能顯著促進(jìn)PC3-DTX細(xì)胞發(fā)生凋亡。Trk1家族在細(xì)胞凋亡、增殖和浸潤(rùn)中發(fā)揮著極其重要的受體信號(hào)調(diào)控作用，在許多腫瘤中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象〔18〕。TrkB能誘導(dǎo)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子發(fā)生磷酸化，通過(guò)激活下游大鼠肉瘤基因(RAS)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)等信號(hào)通路，上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，引起腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移及獲得化療耐藥等〔19〕。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)LINC00595能增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞PC3對(duì)DTX的敏感性。然而，本研究?jī)H為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其具體的有效性還需進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)展開(kāi)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。