慢性丙型肝炎患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平及其臨床意義探討*

賈 坤，蘇建榮，孫 偉

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是感染丙型肝炎病毒(HCV)所致的傳染病。HCV為小RNA病毒，侵犯肝臟后會引起一系列免疫反應，導致慢性肝炎。如不給予治療，可能會發展為肝硬化，嚴重時可誘發肝細胞癌((hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。當HCV感染細胞后，已感染病毒的細胞會分泌包裹病毒RNA的外泌體，以復合物的形式傳播至未感染細胞，并參與未感染細胞生物功能的調控，影響其正常的生理功能[2，3]。目前認為，從分子生物學角度研究CHC的發病機制或有助于后期進行靶向治療，以改善患者預后。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類參與了多種生物學進程的非編碼RNA，包含多種類型的轉錄本。肝細胞癌中高表達的中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA in high expression in HCC，LncRNA-HEIH)能夠影響細胞周期，但其在CHC患者的變化研究尚處于探索階段。本研究分析了CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平變化，旨在探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年9月～2020年7月我院診治的CHC患者77例，男45例，女32例；年齡為45～71歲，平均年齡為(59.5±5.7)歲。符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]的診斷標準。排除合并其他類型肝臟疾病、嚴重的糖尿病和感染性疾病、妊娠或哺乳期婦女、嚴重的心血管疾病和惡性腫瘤患者。另選擇同期我院診治的HCC患者40例，男24例，女16例；年齡43～69歲，平均年齡為(58.7±6.1)歲。符合《原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版)》[5,6]的診斷標準。患者簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理學委員會審核。

1.2 治療方法 給予所有CHC患者標準化，即聚乙二醇化干擾素-α聯合利巴韋林治療6個月。

1.3 血清LncRNA HEIH水平檢測 采集空腹靜脈血3 ml 2份，置于EDTA管中保存，在室溫下靜置30 min，取其中一份，3000 r/m離心10 min，留取上清液，放置于-80℃下保存備檢。定量RT-PCR反應：應用上海生工生物工程股份有限公司合成的PCR引物，基因序列如下，GAPHD-F：5′-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′；GAPHD-R：5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′；LncRNA HEIH-F：5′-AAGAACTCTTCGCTCCAGCC-3′；LncRNA HEIH-R：5′-ACAAAAGCAGACTAGGGCGG-3′。取血清，溶于Reagent Kit液中，加入氯仿，用裂解液分解為水相和有機相，提取含有RNA的上層水相(試劑盒由日本SYBR提供)，加入乙醇，反應條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，用雙蒸水作為對照。PCR反應條件為95℃ 10 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s，共45個循環，采用2-△△法進行計算。

1.4 外泌體LncRNA HEIH水平檢測 提取外泌體，取血清，在4℃下超速離心2 h，加入1×PBS溶液1 ml洗滌沉淀物。然后，再次離心3 h，收集沉淀，置于-80℃下保存備檢。外泌體RNA提取：用PBS重懸沉淀物，取懸液20 μL，滴加于載樣銅網上，用濾紙從濾網側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液負染5 min，室溫晾干，在透射電鏡(COXEM-30 PLUS，韓國)下觀察外泌體形態。然后，應用miRNeasy Mini kit試劑盒提取外泌體總RNA。實時定量RT-PCR反應同上。

1.5 肝活檢 在彩色多普勒超聲診斷儀下定位，使用16 G穿刺針穿刺，取得肝組織，置于甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，常規HE染色，進行肝組織炎癥分級和肝纖維化分期診斷。

2 結果

2.1 兩組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較 CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水顯著低于HCC患者(P<0.05，表1)。

表1 兩組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較

2.2 不同肝組織炎癥和纖維化程度的CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較 肝組織炎癥G0～G1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平顯著高于肝組織炎癥>G2者，肝纖維化S0～S1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平顯著高于肝纖維化>S2者(P<0.05，表2)。

表2 不同肝組織病變的CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較

2.3 血清和外泌體LncRNA HEIH水平與CHC患者肝組織病理學特征的多因素Logistics回歸分析 分析發現血清LncRNA HEIH水平<2.0是預測肝組織炎癥分級和肝纖維化分期顯著的因素(P<0.05，表3)。

表3 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預測CHC患者肝組織病理學特征的Logistics回歸分析

2.4 應答與不應答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較 不應答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平均顯著低于應答組(P<0.05，表4)。

表4 應答與不應答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較

2.5 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預測CHC患者顯著肝組織病變的價值分析 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預測CHC患者肝組織病變顯著的AUC分別為0.764～0.778和0.723～0.736之間(圖1,表5)。

圖1 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預測CHC患者肝組織顯著病變的ROC曲線分析

表5 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預測肝組織病變價值分析

3 討論

外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡，存在于大多數體液中，其在活體內可作為運載脂質、蛋白質和RNA等物質的新型媒介。相關研究指出，外泌體參與了CHC的發生發展過程[7，8]。HCV感染后在發生壞死性肝組織炎癥反應時，會釋放含有LncRNA的外泌體[9，10]。故本研究探究了血清和外泌體中LncRNA HEIH水平在CHC患者的臨床意義。

LncRNA是一類轉錄本長度大于200個核苷酸的RNA，具有mRNA許多相同的結構特性，可以在表觀遺傳學調控、轉錄調控、轉錄后調控等多個層面調控基因水平，參與機體生理和病理學過程[11]。相關報道指出，HCC患者血清和外泌體LncRNA HEIH呈現為高水平，且與疾病進展和預后有關[12，13]。本研究發現，CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平均低于肝癌患者，肝癌患者LncRNA HEIH高水平可能促進了PGKI分泌，以發揮促進血管生成的作用。本研究發現，CHC患者外泌體LncRNA HEIH水平高于血清水平，其臨床意義值得探討[14，15]。

目前認為，CHC的病情進展與炎癥反應有關，減輕機體炎癥程度可延緩疾病進展，減緩肝纖維化的發生[16，17]。LncRNA HEIH可誘發肝癌的發生，或與引發肝纖維化有關。本研究發現，肝組織炎癥G0～G1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平均顯著高于肝組織炎癥>G2者，肝纖維化S0～S1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平均顯著高于肝纖維化>S2者，說明肝組織炎癥分級和肝纖維化分期嚴重的患者存在血清和外泌體LncRNA HEIH低水平現象，檢測它們水平的變化可能有助于判斷肝組織病變。本研究進一步分析發現，血清LncRNA HEIH水平是影響肝組織炎癥分級和肝纖維化分期的預測因素，但目前尚不知其具體機制。有人認為這或許與LncRNA HEIH與臨近的基因相互作用，通過調控染色體構象，改變了基因水平表達[18]。相關研究指出，肝臟可通過產生特異性的外泌體來傳遞纖維化信號[19]，故我們也認為外泌體LncRNA HEIH水平或與肝纖維化的發生有關。本研究發現對抗病毒治療不應答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平顯著低于應答組，可能與這些患者肝組織炎癥反應和纖維化程度較嚴重有關，提示或可通過檢測患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平來預測其抗病毒治療的效果。本研究經進一步分析發現，應用血清和外泌體LncRNA HEIH水平預測CHC患者肝組織炎癥和纖維化的AUC分別較高，具有一定的臨床應用價值。

綜上所述，CHC患者存在血清和外泌體LncRNA HEIH水平異常現象，監測它們的變化對判斷CHC患者肝組織炎癥和纖維化程度或預測抗病毒療效都有一定的臨床應用價值，值得進一步深入研究。