曲美他嗪對急性肝衰竭小鼠肝組織NOX2和NOX4表達的影響

汪 婭，羅婷婷，李 璨，趙文靜，陸 爽

藥物、酒精、嗜肝病毒、肝臟低灌注等諸多因素可造成肝細胞短時間內大規模死亡，肝功能喪失，發展為急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)，其病死率高達95%[1，2]。肝移植是目前明確唯一能挽救ALF患者生命的治療方法。然而，限于供體的嚴重缺乏、巨額醫療費用和手術風險等原因，肝移植還不能廣泛開展[3]。目前，尚未發現確實有效的干預靶點和特效治療ALF的藥物。曲美他嗪 (trimetazidine，TMZ)，其化學名稱為1-(2，3，4-三甲氧芐基)-苯甲基哌嗪，是哌嗪類衍生物，首先作為抗心絞痛藥物應用于臨床，是治療急慢性心力衰竭的重要藥物[4，5]。該藥具有抗氧化作用，增強清除超氧化物和羥基的能力，減少丙二醛(MDA)生成和氧自由基對內皮細胞的損害，保護細胞膜的穩定性[6]。近年來，有研究發現曲美他嗪可顯著減輕缺血再灌注肝損傷并有促進肝細胞再生的治療效果[7]。本研究應用D-氨基半乳糖聯合脂多糖(lipopolysaccharide/D-galactosamine，D-Galn/LPS)誘導小鼠ALF模型，以鹽酸曲美他嗪作為干預藥物，從氧化應激改變方面探討了曲美他嗪對ALF小鼠的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 D-Galn購于美國Sigma公司，LPS購于北京索萊寶科技有限公司，兔抗鼠NOX2、抗NOX4 和抗GAPDH購于美國Abcam公司，檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、過氧化物酶(CAT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，鹽酸曲美他嗪片購于施維雅(天津)制藥有限公司，還原型谷胱甘肽片購于重慶藥友制藥有限公司。LEICA顯微鏡和OlympusBX41圖像采集系統(日本OLYMPUS公司)，酶標儀(BIO-RAD公司)。

1.2 動物模型的制備 65只6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠購自重慶陸軍軍醫大學實驗動物中心，隨機將小鼠分為6組，即對照組(n=10)、模型組(n=15)、小、中、大劑量曲美他嗪組(n=10)和還原型谷胱甘肽處理組(n=10)，給予對照組生理鹽水腹腔內注射；在模型組，將D-Galn 500 mg 和LPS 50 μg加入無菌生理鹽水10 ml，制備成50 mg D-Galn/5 μg LPS/ml溶液，取300 mg D-Galn/10 μg LPS.kg-1腹腔內注射；在小、中、大劑量鹽酸曲美他嗪組，將鹽酸曲美他嗪10 mg溶于無菌生理鹽水10 ml，制備成1 mg/ml溶液，分別以5 mg.kg-1.d-1、10mg.kg-1.d-1和20 mg.kg-1.d-1灌胃，持續1 w后處理同模型組；將還原型谷胱甘肽片10 mg制備成1 mg/ml溶液，以20 mg.kg-1.d-1灌胃，持續1 w后處理同模型組。各組小鼠均在處理6 h后處死。從眼球靜脈收集血液，分離血清。取部分肝組織，制備10%組織勻漿。取上清液。經門靜脈灌注，收集各組相同部位肝組織，用低聚甲醛溶液固定48 h，制片。

1.3 肝組織 NOX2/4 mRNA水平和蛋白表達檢測 采用RT-PCR法，取凍存的肝組織50 mg，抽提組織總RNA，加入逆轉錄試劑，逆轉錄成cDNA。取cDNA加入SYBR熒光染料和上下游引物，進行PCR擴增；在實驗過程中嚴格設立內參照GAPDH；在指數區內設定參數，讀取CT值，經負對數轉化后，用目的片段與內參片段的比值作為該標本目的基因水平；采用Western blot法，提取各組肝組織總蛋白，用BCA法檢測肝臟蛋白濃度，使各組蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液，煮15 min，使蛋白變性，各組取相同體積的蛋白樣品，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、封閉。然后，分別加入抗NOX2和抗NOX4，孵育過夜，次日用TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育50 min，曝光，使用掃膜儀掃描并采圖，并應用軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 各組肝組織病理學表現 與對照組比，模型組小鼠肝細胞壞死嚴重，炎癥細胞浸潤明顯；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組小鼠肝組織病理學損傷均有所改善(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學表現(HE，200×)A:對照組；B:模型組；C:谷胱甘肽處理組；D:小劑量曲美他嗪處理組；E:中劑量曲美他嗪處理組；F:大劑量曲美他嗪處理組

2.2 各組血清ALT和AST水平比較 與對照組比，模型組血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組血清ALT和AST水平顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組血清ALT和AST水平比較

2.3 各組肝組織勻漿MDA和CAT含量變化 與對照組比，模型組MDA含量升高，而CAT含量降低(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組MDA含量顯著降低，而CAT含量顯著升高(P<0.05，表2)。

表2 各組肝組織MDA和CAT水平比較

2.4 各組肝組織NOX2/4 mRNA水平比較 與對照組比，模型組NOX2/4 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組NOX2/4 mRNA水平顯著減低(P<0.05，表3)。

表3 各組肝組織NOX2/4 mRNA水平比較

2.5 各組肝組織NOX2/4 蛋白表達量變化 與對照組比，模型組NOX2/4 蛋白相對表達量顯著增強(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組NOX2/4 蛋白相對表達量顯著減弱(P<0.05，表4)。

表4 各組肝組織NOX2/4 蛋白相對表達量比較

圖2 各組小鼠肝組織NOX2/4蛋白表達情況A:對照組；B:模型組；C:谷胱甘肽處理組；D:小劑量曲美他嗪處理組；E:中劑量曲美他嗪處理組；F:大劑量曲美他嗪處理組

3 討論

ALF是一種罕見且嚴重的綜合征，在沒有已知潛在慢性肝病患者的肝臟受到急性打擊后，正常肝功能迅速惡化，表現為黃疸、凝血功能障礙、肝性腦病為特征，患者多因并發多器官衰竭而死亡，其病死率極高。氧化應激是指細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)過度產生, 內源性抗氧化防御功能減弱，致使兩者之間不平衡，引起組織或細胞損傷的狀態。氧化應激是許多肝臟疾病的發病機制，在肝臟疾病的發展過程中起著重要作用[8-11]。

LPS是革蘭陰性細菌細胞內毒素的主要成分。有研究報道LPS可以誘導NOX激活[21]。同時，肝臟kuffer細胞中的吞噬型NOX(即NOX2)可被細菌產物(如LPS)激活產生大量的ROS[22]。 D-Galn是肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝細胞彌漫性壞死和炎癥。有研究者使用Galn/LPS誘導大鼠ALF模型，觀察到與對照組相比，ALF大鼠肝組織NOX4蛋白表達顯著增加[23]。

曲美他嗪是一種游離脂肪酸氧化抑制劑。研究發現曲美他嗪抑制NOX2能改善糖尿病相關的心肌病[24]。本實驗結果顯示，曲美他嗪干預可減輕D-Galn/LPS誘導的ALF小鼠肝損傷程度，中、大劑量曲美他嗪灌胃小鼠血清ALT和AST水平下降，肝組織勻漿MDA含量降低，而CAT含量升高。同時，NOX2/4水平減低。以上結果表明曲美他嗪可能通過下調肝組織NOX2/4表達，減輕氧化應激損傷，改善D-Galn/LPS誘導的小鼠急性肝衰竭。本研究以鹽酸曲美他嗪為干預藥物，從NOX2/4介導的氧化應激方向探究了抗氧化劑對ALF的保護作用，進一步提供了對ALF發病機制的深入了解，期望對ALF的抗氧化治療提供新的思路。本研究未在細胞水平進一步驗證曲美他嗪下調肝組織NOX2/4表達的機制，后續將進行深入研究。