小檗堿靶向HDAC/H3K9ac/KLF4抑制棕櫚酸誘導的HepG2脂肪變性體外實驗研究*

李經緯，王子璇，王夢雨，黃瑞賢，信豐智，范建高，汪保燦

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)可以導致2型糖尿病、肝硬化和肝癌及其肥胖相關癌癥等的發生[1-4]。小檗堿(berberine， BBR)是一種天然的異喹啉類生物堿，存在于小檗、黃連、黃柏等多種藥用植物中。近年來有研究發現，BBR可以緩解NAFLD[5,6]，減輕NAFLD患者肝組織脂肪變，同時也可以改善胰島素抵抗(IR)、治療代謝綜合征、降低膽固醇等。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDACs)是一類蛋白酶，在染色體的結構修飾和基因表達調控過程中發揮著重要的作用[7]。在高脂飲食誘導的NAFLD模型小鼠，可以通過抑制肝組織HDAC活性，使組蛋白H3第9位賴氨酸乙酰化(histone H3 lysine residue 9 acetylation，H3K9ac)顯著增加，從而有利于DNA與組蛋白八聚體的解離，使各種轉錄因子和協同轉錄因子能與DNA結合位點特異性結合，激活基因轉錄[8]。H3K9ac水平升高可以通過促進過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α， PPARα)的活化，從而激活脂肪酸β氧化，緩解NAFLD病變[9]。BBR可以顯著抑制葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)誘導的小鼠脾細胞HDAC活性，起到近似于HDAC抑制劑曲古菌素A(trichostatin A，TSA)的作用[10]。BBR也可以顯著抑制人類肺癌細胞系A549細胞HDAC的表達[11]。Krüppel樣因子4 (Krüppel-like factor4，KLF4)是一種鋅指結構的轉錄因子，在NAFLD患者肝組織KLF4表達水平較正常人顯著下降[12]。KLF4可以通過阻斷Apelin信號通路抑制急性肝損傷時的肝細胞脂肪變性13]。KLF4表達增加抑制了游離脂肪酸(free fatty acids，FFAs)誘導的脂肪細胞炎癥反應[14]。在白血病細胞K562和人食管癌細胞系KYSE150等細胞系H3K9ac水平增加可使KLF4表達水平顯著增加[15]。本研究應用棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導HepG2細胞構建NAFLD細胞模型，觀察了BBR對細胞HDAC1、H3K9ac、KLF4、SREBP-1c和PPARγ表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人肝癌細胞株HepG2來自于美國模式菌收集中心(American type culture collection，ATCC)；BBR(Sigma公司)；PA(Sigma公司)；Lipofectmin 2000(Invitrogen公司)；抗-HDAC1 (武漢谷歌生物)；抗-H3K9ac(Abcam公司)；抗-KLF4(Proteintech公司)；抗- SREBP-1c(Proteintech公司)；抗- PPARγ(武漢谷歌生物)；pEX-3-HDAC1過表達質粒(Ov-HDAC1)和SiRNA-KLF4-1/2(上海吉瑪基因)；油紅O(Sigma公司)；檢測TNF-α、IL-1β和IL-6 的ELISA 試劑盒(Solarbio公司)；EZ-ChIP試劑盒(Millipore公司)。

1.2 細胞培養 取HepG2細胞，隨機分為對照組、模型組和藥物干預組。以2×105接種于6孔板(2 ml/孔)，培養24 h，用200 μM PA刺激培養24 h。在BBR處理組，用完全培養基將20 mM BBR儲存液配置成為20 μM BBR工作液。取HepG2細胞，以2×105接種于6孔板(2 ml/孔)培養24 h，棄去原培養基，加入20 μM BBR工作液2 ml，繼續培養24 h。質粒和small interfering RNA轉染：取HepG2細胞，以2×105接種于6孔板，培養24 h。隨機分為HDAC1過表達質粒轉染組(Ov-HDAC1)、空質粒轉染組(Ov-NC)、SiRNA-KLF4-1轉染組(SiRNA-KLF4-1)、SiRNA-KLF4-2轉染組(SiRNA-KLF4-2)和SiRNA-NC轉染組(SiRNA-NC)。在轉染前，棄去6孔板中含有血清的培養基，用PBS沖洗1～2次，加入Opti-MEM 培養基(1500 μl/孔)。取Lipofectamine 2000轉染試劑5 μl和質粒DNA 3 μg分別與opti-MEM培養基250 μl混合(使用同樣的方法轉染SiRNA)，混勻后靜置10 min，將兩者再混勻后靜置20 min，在每個孔中加入混合液500 μl，培養6 h，更換完全培養基繼續培養。

1.3 細胞蛋白表達檢測 采用Western blot法，收集細胞，提取總蛋白，采用BCA法定量檢測蛋白濃度。按照Western blot步驟對蛋白樣品電泳和電轉移，用5%牛奶封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜。次日，加二抗，室溫下孵育1 h，使用ECL發光試劑盒顯色，進行顯色、掃描、拍照，分析蛋白條帶灰度。

1.4 HepG2細胞脂質沉積檢測 使用油紅O染色，在顯微鏡下觀察細胞形態和細胞內脂滴。

1.5 細胞培養上清細胞因子檢測 采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.6 細胞KLF4啟動子區H3K9ac水平檢測 采用CHIP-qPCR法，使用EZ-ChIP試劑盒裂解HepG2細胞，超聲處理，將染色質切至200～700 bp長度，離心后取上清液10 μl作為Input，其余上清液用于之后的實驗。將交聯的DNA與抗H3K9ac抗體和陰性對照抗IgG抗體在4℃孵育過夜。加入NaCL使DNA去交聯，使用蛋白酶K消化去除蛋白質，用純化后的DNA用于PCR試驗。所用的引物由上海生工生物有限公司合成：KLF4啟動子上游引物序列為5′-GAACAGGCGGAAAGAGGC-3′，下游引物序列為5′-CAGGAGAATCGCTTGGACG-3′，GAPDH上游引物序列為5′-CTCCTGCACCACCAACTGCT-3′，下游引物序列為5′-GGGCCATCCACAGTCTTCTG-3′。

2 結果

2.1 各組細胞HDACs和H3K9ac蛋白表達水平比較 PA處理顯著提高了HepG2細胞HDAC1蛋白表達水平(P<0.001)，而降低了H3K9ac蛋白表達水平(P<0.001)；在PA誘導的HepG2細胞，BBR抑制了HDAC1蛋白的過量表達(P<0.01)，而顯著提高了H3K9ac蛋白的表達水平(P<0.01，圖1)。

圖1 各組細胞HDAC1和H3K9ac蛋白表達比較與對照組比，***P<0.001；與模型組比，##P<0.01

2.2 轉染HDAC1過表達重組質粒對HepG2細胞H3K9ac水平的影響 轉染HDAC1過表達重組質粒顯著增加了HepG2細胞HDAC1蛋白水平(P<0.001)，證實HDAC1過表達質粒轉染成功。在PA誘導的HepG2細胞，加入Ov-HDAC1質粒顯著降低了HepG2細胞H3K9ac水平(P<0.001，圖2)。

圖2 HDAC1過表達細胞H3K9ac水平變化A：轉染HDAC1過表達質粒HepG2細胞HDAC1蛋白表達變化；B：轉染HDAC1過表達質粒HepG2細胞H3K9ac水平變化;與Ov-NC組比，***P<0.001

2.3 BBR在PA誘導的HepG2細胞通過調節H3K9ac水平激活KLF4的表達 與對照組比，PA誘導的HepG2細胞KLF4蛋白表達顯著降低(P<0.001)，而BBR或丁酸鈉(一種HDAC抑制劑)處理后，HepG2細胞KLF4蛋白表達顯著增加(P<0.01，圖3A)。此外，CHIP-qPCR檢測結果顯示，BBR處理后KLF4啟動子區H3K9ac水平顯著增加(P<0.001，圖3B)，提示BBR通過提高HepG2細胞H3K9ac水平激活KLF4的表達。

圖3 各組細胞KLF4蛋白表達水平A：KLF4蛋白表達水平；B：兩組細胞經抗H3K9ac抗體處理后KLF4啟動子表達水平;與對照組比，***P<0.001；與模型組比，##P<0.01，###P<0.001

2.4 BBR在PA誘導的HepG2細胞通過激活KLF4減輕細胞脂質積聚 與SiRNA-NC處理組比，轉染SiRNA-KLF4-1/2的HepG2細胞KLF4蛋白表達水平顯著下降(P<0.01，圖4A)；與對照組比，PA誘導加劇了HepG2細胞脂質沉積；與模型組比，BBR處理緩解了PA誘導引起的脂質沉積，而KLF4的沉默逆轉了BBR對HepG2細胞脂質積累的影響(圖4B)。

圖4 沉默KLF4基因抑制了BBR對PA 誘導的HepG2細胞脂質沉積的保護作用A：轉染SiRNA的HepG2細胞KLF4蛋白表達變化；B：各組HepG2細胞脂質沉積情況(油紅O，100×);與SiRNA-NC組比，**P<0.01，***P<0.001

2.5 BBR在PA誘導的HepG2細胞通過激活KLF4改善炎癥反應 與對照組比，PA誘導促進了HepG2細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P<0.001)，而BBR處理可以顯著改善PA誘導引起的炎癥因子分泌(P<0.001)。同樣地，沉默KLF4逆轉了BBR的這種改善作用(圖5)。

圖5 各組細胞培養上清細胞因子水平比較與對照組比，***P<0.001；與模型組比，###P<0.001；與藥物干預組比，$$P<0.01，$$$P<0.001

2.6 BBR在PA誘導的HepG2細胞通過激活KLF4調控脂質代謝相關基因表達 與對照組比，PA誘導可以顯著促進HepG2細胞脂質合成相關基因SREBP-1c表達(P<0.001)，同時降低脂質分解相關基因PPARγ表達水平(P<0.001)；與模型組比，BBR處理顯著抑制SREBP-1c表達(P<0.001)，同時促進了PPARγ表達(P<0.001)，而沉默KLF4削弱了BBR對脂質代謝相關基因表達的調節作用(P<0.001，圖6)。

圖6 各組細胞脂質代謝相關蛋白表達水平比較與對照組比，***P<0.001；與模型組比， ###P<0.001；與藥物干預組比， $$$P<0.001

3 討論

PA是FFAs的一種，可刺激細胞炎癥因子的產生，促進肝細胞的脂質積累。在本研究中，我們建立了經典的PA誘導的HepG2細胞脂肪變細胞模型，發現PA誘導的HepG2細胞脂質沉積顯著增加，細胞培養上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平也顯著增加，證實NAFLD細胞模型構建成功。

越來越多的證據表明，BBR能保護肝臟功能。研究發現BBR可以通過激活Nrf2/HO-1和PPARγ信號通路減輕甲氨蝶呤誘導的肝損傷大鼠氧化應激和細胞凋亡。BBR也可通過抑制炎癥反應和線粒體依賴性的細胞凋亡，保護急性肝衰竭(acute liver failure，ALF) 小鼠。在本研究，我們在體外應用BBR刺激PA誘導的HepG2細胞，結果發現BBR可以顯著改善PA誘導的肝細胞脂質沉積，降低細胞促炎細胞因子水平，提示BBR可以在體外緩解PA誘導的HepG2細胞脂肪變。

HDACs是一類通過組蛋白和非組蛋白去乙酰化來調控轉錄過程的酶家族。HDAC1可以通過調控組蛋白H3K9ac水平在同型半胱氨酸介導的脂質代謝紊亂過程中發揮關鍵的作用。此外，預防心血管疾病的藥物洛伐他汀通過降低HDAC1表達，使H3K9ac水平增加，從而抑制巨噬細胞的炎癥反應。丁酸鈉(一種HDAC抑制劑)可以通過降低HDAC 1蛋白表達使H3K9ac水平上升，進而促進PPARα的活化，減輕肝脂肪變。HDAC抑制劑還能誘導腸上皮細胞、心肌細胞和血管平滑肌細胞KLF4表達，而甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)可以通過提高KLF4啟動子區H3K9ac水平進而激活KLF4的表達。KLF4的激活可能在緩解肝脂肪變方面發揮一定的作用。在本研究，我們發現PA誘導的HepG2細胞經BBR處理后，HDAC1表達下降，H3K9ac水平升高，而HDAC1的過表達抑制了H3K9ac水平，表明HDAC1對H3K9ac的表達有調節作用。本研究還發現，BBR通過調節H3K9ac水平來提高KLF4的表達，而沉默KLF4則逆轉了BBR對PA誘導的HepG2細胞脂質沉積和炎癥反應的保護作用，提示KLF4的激活參與了BBR對肝脂肪變的干預作用。