新型石英晶體微天平分子鍵裂免疫傳感器的研制

張潤 司士輝 扶梅 馮浪霞

中南大學化學化工學院，湖南長沙 410083

0 前言

石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）是一種常用的檢測負載質量的聲波傳感器，其生物傳感器在應用中一直存在非特異性結合的干擾問題，雜質附著位點導致對目標物質的檢測存在較大誤差，而分子鍵裂方法可以有效解決這個問題[1]。調幅調頻分子鍵裂方法可實現不同強度分子鍵的差異性斷裂，甩脫掉表面結合強度較弱的非特異性吸附干擾物，提高生物檢測的抗干擾性及檢測精度，可實現親和性生物傳感界面的原位再生[2]。DULTSEV F N等[3]首次提出了通過電噪聲監測抗原抗體鍵裂的方法，分別對聚苯乙烯與金、鏈霉親和素與生物素以及酰胺鍵進行了鍵裂實驗，不同強度的相互作用隨著電壓變化幅值升高依次斷裂。COOPER M A等[4]提出了鍵裂掃描概念（rupture event scanning，REVSTM），通過鍵裂的方法檢測細菌并定量樣品中的細菌數，增加QCM的振蕩幅度檢測細菌與表面相互作用破裂時的聲噪聲，可定量至少超過6個數量級，檢測10種細菌。DULTSEV F N等[5]利用QCM快速檢測乙型肝炎病毒，通過病毒從QCM表面振蕩脫離的電壓，可檢測大約140～150個單獨的病毒。YUAN Y J等[6]設計了生物素和鏈霉親和素相互作用的鍵裂實驗，通過檢測QCM的基頻及3次諧波附近的窄帶頻率響應和“噪聲”信號監測鍵裂過程，并根據鍵能大小區分抗原。KHOBRAGADE S等[7]通過在石英晶體諧振器固定抗大腸桿菌適體在非線性范圍內檢測大腸桿菌（E. coli），得到3次傅立葉諧波（3f）電流的變化與大腸桿菌濃度定量相關性，靈敏度為105～108 cfu/mL。通過諧振調幅引起分子鍵裂得到頻率響應和電噪聲響應，可以檢測晶體表面負載質量并區分不同生物分子附著親和力，得到相應的力學參數和熱力學參數。本研究基于DDS數字信號發生器開發了一種調幅調頻石英晶體微天平頻率檢測系統，與文獻中應用的方法不同，采用了差頻的方法得到分子鍵裂時的頻率信號，實時監測諧振調幅后的信號變化，并通過頻率信號和激勵電壓區分不同生物分子間相互作用的強弱。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

9.98 MHz石英晶體（深圳市仁路科技有限公司）；AD 9854信號發生器（美國Analog Devices公司）；PID控溫系統（日本株式會社），流動注射泵（南京潤澤流體控制設備有限公司）。KCl、NaCl、Na2HPO4、KH2PO4等試劑為分析純，均購于國藥集團化學試劑有限公司；免疫球蛋白IgG、蛋白質A等為分子生物學級，購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 分子鍵裂型QCM生物傳感系統原理及構造

1.2.1 儀器原理

分子鍵裂型石英晶體微天平生物傳感系統工作原理是通過Arduino單片機控制數字信號發生器DDS 9854產生頻率可調的正弦波，并激勵9.98 MHz鍍金電極的壓電石英晶體。本系統采用了石英晶體自主諧振電路法和被動激勵振蕩法兩種方式。運行過程中，在低振幅（2 V）下以自主諧振電路法測定晶體頻率；在諧振調幅模式時，通過高速繼電器切換到被動調幅激勵電路，由數控放大器調節不同激勵電壓實現諧振調幅，增大石英晶體表面剪切動量，使晶體表面物質搖擺速度增快，從而實現分子鍵裂。儀器原理圖如圖1所示。

1.2.2 DDS信號發生器

采用美國ADI公司AD 9854高度集成的芯片，由Arduino控制產生頻率和相位都非常穩定、幅度編程可調的正弦信號。通過直接數字頻率合成（direct digital synthesis，DDS）技術以數控振蕩的方式產生頻率和相位可控的正弦波，并激勵壓電石英晶體，通過信號發生器中的D/A轉換器將數字信號轉變為模擬信號，產生高分辨率、低噪聲、高精度的頻率信號。DDS信號發生器原理圖如圖2所示。

1.2.3 差頻方法

分子鍵裂型石英晶體微天平生物傳感系統采用了差頻方法來獲得諧振頻率，以DDS信號發生器內可調的頻率信號作為參考頻率源，不斷調節使其與測量晶體頻率值在一定范圍內，通過差頻電路得到測量晶體頻率值與基準頻率源的差值，即差頻信號值，從而提高測量精度。參考頻率信號和檢測頻率信號經混頻電路，輸出即為差頻值。在相同電路中得到差頻值，可有效減小溫度、電容、晶體老化、閾值電壓等對檢測的影響。

1.2.4 傳感系統構造

諧振調幅壓電石英晶體分子鍵裂生物傳感系統包括軟件部分和硬件部分，實物和內部結構如4圖所示。軟件部分包括信號放大模塊、數據處理模塊、頻率存儲模塊；硬件部分包括差頻電路板、調幅電路板、易拆卸檢測池（9.98 MHz晶振）、流動注射泵、SD卡存儲器、7英寸液晶顯示觸摸屏、PID控溫模塊、USB電腦串口。石英晶體工作頻率為5～90 MHz，頻率分辨率為±1 Hz。可3倍、5倍調幅諧振。10 MHz以下電壓可達21.00 V，分辨率為1 V，激勵電壓調節精度為±10 mV。

根據傳感系統的要求，以及目前的微電子技術，諧振調幅傳感系統的結構為圖5所示的電源、DDS信號發生、QCM、信號采集處理及其他5個模塊。

諧振調幅生物傳感系統主要分為5個模塊，各模塊功能為：（1）電源模塊：在室外，通過兩個12 V的移動電源供電；在實驗室內，通過電源適配器給儀器供電并使用LM 2596電源調節器調節電源，保證儀器電壓穩定正常；（2）DDS信號發生模塊：單片機Arduino控制DDS 9854產生可調正弦波，以振蕩法激勵QCM使其振蕩，信號放大經過低通濾波器（LPF）之后相敏檢波，得到參考頻率差，通過數控放大器（AMP）調節不同激勵電壓；（3）QCM模塊：采用AT切型9.98 MHz雙面金電極石英晶體，設計了方便拆卸的石英晶體檢測池和配套的電極底座，如圖6所示；（4）信號采集處理模塊：QCM響應信號由濾波器濾波處理后，經過模數轉換器（ADC）后，再經放大器（AMP）并聯電路增益電壓信號；（5）其他模塊，包括流動注射系統，如圖6（c）所示、PID控溫系統，如圖6（d）所示、散熱系統、數據顯示存儲模塊等。

1.2.5 軟件系統

本系統采用C++語言，對Arduino、PID控溫系統和流動注射系統進行編譯。打開儀器后，在選擇面板選擇等幅（2 V）模式和調幅電壓模式，設置溫度及流速，采集并自動存儲數據。

2 結果與討論

2.1 儀器性能測試

參考頻率默認為10.00 MHz。使用9.98 MHz的壓電石英晶振，開機進行自主等幅諧振（振蕩電壓2 V）頻率檢測，待初始頻率穩定，選擇5.00～12.00 V電壓調幅。先以3 min的等幅模式測基準頻率，再自動調至5.00 V激勵模式，調幅30 s，按中斷鍵后記錄調幅后的頻率信號3 min；之后為30 s的12.00 V調幅模式，記錄調幅后的頻率信號，檢測儀器在氣相、液相（純水、PBS中）調幅后頻率的變化穩定性。

2.1.1 儀器的穩定性

在空氣中，儀器在等幅模式的差頻響應值見圖7（a），頻率信號大致為一條直線。在檢測50 min內，以基頻為參考，頻率相對偏差為0.981 Hz，波動不超過±1 Hz，頻率變化值為0.08 Hz/min。在調幅模式下，頻率響應見圖7（b），5.00 V和12 .00 V電壓激勵30 s后，頻率變化在10 s內迅速恢復穩定。不同調幅電壓激勵后的差頻值見圖7（c），總的頻率變化為11 Hz，平均變化0.65 Hz/V，說明在氣相中儀器在不同調幅電壓下頻率響應稍有波動，但在一定范圍內穩定。在純水中，儀器在等幅模式的差頻響應見圖7（d），頻率響應幾乎為一條直線，在檢測的30 min內，頻率變化相對偏差為1.756 Hz，變化值為0.33 Hz/min。儀器在調幅模式下的頻率響應見圖7（e），在5.00 V和12.00 V電壓激勵30 s后，頻率迅速升高，但在30 s內恢復基頻。在不同調幅電壓激勵后的差頻值見圖7（f），總的頻率變化為24 Hz，平均變化1.41 Hz/V。在純水環境中，儀器測定的頻率波動較氣相中更大，主要是受溫度和激勵電壓變化的影響。以上實驗表明，儀器在氣相和液相中晶體都能正常起振，穩定性良好。

2.1.2 流動注射條件下的穩定性

在等幅模式下，轉動流速選擇旋鈕，通過流動注射泵以不同流速注入磷酸緩沖溶液（PBS），3 min內不同流速下的頻率信號響應如圖8（a）所示，在同流速下，頻率信號幾乎為一條直線，調節不同流速后頻率稍有變動，但仍穩定。不同流速下注入PBS的頻率信號變化的相對偏差如圖8（b）所示，不同流速下頻率相對偏差小于4 Hz，在500 mL/min流速下相對偏差最小為1.625 Hz，說明儀器在流動注射PBS溶液下，晶體正常起振且信號穩定。

在等幅條件下，以500 mL/min流速流動注入PBS溶液，差頻變化如圖9（a）所示，頻率響應大致為一條直線，在0～17 Hz的范圍內波動，在22 min內，頻率平均變化值為0.766 Hz/min。頻率波動較氣相和純水中更大，主要原因是晶體頻率變化與粘度和密度相關，PBS的粘度和密度比純水大，且頻率信號容易受溫度的影響。儀器在調幅模式下流動注入PBS的差頻值見圖9（b），在5.00 V電壓激勵30 s后，頻率幾乎無變化。在12.00 V電壓激勵30 s后，頻率迅速升高，在50 s內恢復穩定，受調幅電壓的影響，頻率變化較大，主要是由于溶液粘度和密度的影響，使晶體剪切振動加劇，但在短時間內可恢復穩定，不會影響鍵裂實驗結果。在不同調幅電壓激勵后的差頻值見圖9（c），頻率變化為28 Hz，平均變化1.65 Hz/V，隨著激勵電壓升高，頻率變化升高，這主要受溫度及PBS溶液本身性質的影響。在流動注入PBS溶液下，調幅電壓激勵后，晶體可正常起振，且在一定范圍內穩定性良好。

2.2 鍵裂實驗

2.2.1 調幅電壓激勵抑制蛋白質A和IgG結合過程

將晶體固定于流動注射系統配套檢測池，打開儀器，檢測初始頻率；待頻率穩定，打開流動注射泵，以500 μL/min的流速注射0.1 mg/mL PBS溶液，當溶液流過晶體，頻率急劇下降；待頻率穩定，記錄基本頻率f0，將準備好的2 mL，包含0.01 mg/mL蛋白質A的PBS溶液（pH=7.4）注入流通池中并孵育1 h；將蛋白質A固定在導電層表面，然后把不同濃度的IgG的PBS溶液注射到流通池中，以0.1 mg/mL的IgG和0.01 mg/mL蛋白質A的相互作用進行鍵裂實驗；待結合穩定后開啟不同電壓的調幅模式，激勵30 s后記錄調幅后的頻率數據。

每次注射IgG后頻率有所降低，說明IgG分子與蛋白質A結合被吸附在了QCM的表面。不同濃度下存在吸附和平衡兩個階段，其中，不同濃度下的頻率變化值如圖10（a）所示，QCM的頻率變化隨著IgG濃度的增大而增大。在不同調幅電壓下抑制IgG和蛋白質A相結合，結果如圖10（b）所示，隨著調幅電壓升高而抑制增加，從5.00 V電壓到20.00 V其抑制率在12.83%到42.78%之間，說明在蛋白質A和IgG相互作用時，施加的調幅電壓越高，抑制二者結合的效果越明顯。

2.2.2 蛋白質A和IgG結合后的鍵裂響應

將蛋白質A固定于晶體表面，依次注入0.01 mg/mL的BSA和IgG的PBS溶液，頻率分別下降54 Hz和233 Hz，其頻率變化如圖11（a）所示。待頻率穩定后開啟調幅模式，在不同調幅電壓激勵下的頻率響應如圖11（b）所示。在低電壓調幅下頻率幾乎無變動，隨著電壓升高，在13 V時頻率上升了91 Hz，比BSA的結合下降頻率高，因為BSA與蛋白質A層結合較弱，由頻率值可得，BSA和未結合牢固的IgG被振蕩甩脫。在20.00 V電壓激勵后，頻率上升153 Hz，在高調幅電壓下甩脫了65.67%結合了的IgG。說明IgG與蛋白質A的相互作用較BSA強，即本傳感系統在不同調幅電壓下可區分不同蛋白之間相互作用的強弱。

3 結論

本文研制的諧振調幅石英晶體微天平分子鍵裂型傳感系統可實時檢測生物分子鍵裂的過程，通過諧振調幅可抑制分子間的結合過程，在短時間內可獲得分子鍵裂前后的差頻信號，區分不同強弱的相互作用，簡化了檢測過程，可應用于表面固定化親和性生物檢測技術領域。