醫用臭氧對宮頸癌細胞增殖和遷移抑制作用的初步研究

李錦程，唐水英，曾 濤，何曉峰

子宮頸癌嚴重影響女性健康，目前治療手段包括手術和放化療，存在易復發和5年生存率較低問題，需要尋求新的治療手段［1］。臭氧應用于治療感染、腫瘤輔助治療以及介入手術已取得良好療效［2-3］。有研究報道臭氧療法在兔VX2腫瘤模型中取得一定療效［4-5］。臭氧通過誘導可控性氧化應激刺激人體適應性抗氧化反應，但不會導致抗氧化劑顯著增加。在適當濃度下，大多數腫瘤細胞內源性抗氧化機制通常受到削弱［6］。有研究推測臭氧抗癌作用涉及活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，ROS積累可抑制核因子（NF）-κB激活，而NF-κB在細胞增殖中起著關鍵作用［7-8］。同時有研究表明，NF-κB信號通路可能是臭氧作用的主要機制之一，包括刺激內源性抗氧化系統上調、激活免疫功能和抑制炎癥過程［9］。目前臭氧已嘗試應用于介入治療輸卵管炎癥及輸卵管梗阻［10-11］。本研究探討醫用臭氧對宮頸癌生長和遷移是否有抑制作用，分析ROS積累、NF-κB信號通路與細胞遷移間的關系，為臭氧介入治療宮頸癌提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌Hela細胞（中國科學院細胞庫），Dulbecco極限必需培養基（DMEM）（高糖）、胰酶、胎牛血清（美國Gibco公司），細胞計數試劑盒（CCK）-8（廣州貴靈生物科技公司），N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、ROS檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司），NF-κB、上皮-間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關蛋白抗體（美國CST公司），結晶紫染色液（廣州杰特偉生物科技公司），醫用臭氧發生器（淄博前沿醫療器械公司）。

1.2 細胞培養與處理

Hela細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM中。研究分別設空白組、NAC處理組、NAC和臭氧共處理組、臭氧組，其中臭氧濃度為半最大效應濃度（concentration for 50%of maximal effect，EC50），由CCK-8檢測結果所求得。將細胞消化計數成100 W/mL細胞懸液，取5 mL裝入20 mL注射器中，空白組細胞不做任何處理，NAC處理組細胞加入5%體積60 mmol/mL NAC溶液預處理20 min，NAC和臭氧共處理組是在NAC預處理基礎上加入等體積臭氧氣體顛倒混勻15 min，臭氧組不加NAC，臭氧處理如上。

1.3 CCK-8檢測細胞活力

分別用0、5、10、20、30 mg/mL臭氧處理細胞后，將2×103細胞分別種植于96孔板，培養至24 h、36 h、48 h等3個檢測時間點后棄去舊培養基，每孔加入100μL CCK-8工作液，于孵箱孵育2 h后用酶標儀在450 nm波長條件下檢測吸光度。根據前一步實驗得到EC50值和培養時間，由上述分組再進行檢測。

1.4 細胞集落實驗

4組細胞處理完后，按照500/孔的密度將細胞接種于6孔板中，隨后置于孵箱培育，持續培養2周。培養完畢棄去舊培養基，甲醇固定后用結晶紫染色液進行染色攝影并計數。

1.5 ROS水平檢測

4組細胞處理完后按100 W/皿密度接種于中皿中，培養24 h后用二氯二乙酸酯（DCFH-DA）探針進行裝載，流式細胞儀檢測ROS水平。

1.6 劃痕實驗

在60 mm培養皿背面用馬克筆劃3條直線，每皿加入200 W細胞，待其長滿。將培養基加入注射器中，按其預設4組：空白組（不做處理）、NAC處理組（加入培養體系8%體積NAC溶液預處理20 min）、NAC和臭氧共同處理組（NAC預處理基礎上加入等體積臭氧顛倒混勻15 min）、臭氧組（僅加入等體積臭氧氣體充分混合15 min）。將上述處理過的培養基加入長滿細胞的皿中培養15 min，用槍頭沿著畫的直線垂直方向進行劃痕，棄去培養基并洗滌2次，加入無血清培養基進行培養。于0 h、12 h、24 h等3個觀察時間點進行攝影記錄，隨后進行劃痕愈合面積統計和分析。

1.7 Transwell實驗

4組細胞處理后，加入到小室的上室，細胞密度為5×104，體積為200μL，培養基中不含血清。下室添加600μL含30%胎牛血清培養基。孵育24 h后用濕棉簽去除上室細胞。甲醇固定移行細胞后，結晶紫溶液染色攝影并計數。

1.8 蛋白質印跡法檢測NF-κB和EMT相關蛋白

4組細胞處理并培養24 h后進行裂解收集，紫光分光光度計測定蛋白濃度。每組添加100μg蛋白量上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，200 mA恒流用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜進行轉膜，10%牛血清白蛋白（BSA）進行封閉，1∶1 000一抗濃度4℃孵育過夜，次日用Tris緩沖0.9%NaCl溶液（TBST）洗膜3次，1∶5 000二抗濃度室溫孵育1 h后，再次TBST洗膜3次，電化學發光（ECL）顯影。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參對照。

1.9 統計學分析

每次實驗均重復3次。采用GraphPad Prism 7.0版軟件進行統計學分析，數據結果以±s表示。多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臭氧處理抑制Hela細胞增殖

CCK-8法檢測Hela細胞增殖情況見圖1①，臭氧濃度5、10、20、30 mg/mL對Hela細胞增殖均有明顯的抑制作用，具時間和濃度依賴性，求得24 h時EC50為10 mg/mL，后續實驗均以10 mg/mL濃度培養24 h方案；NAC抵消臭氧誘導的Hela細胞增殖抑制作用（圖1②）。細胞集落實驗表明，臭氧處理可明顯減少Hela細胞集落數，同樣NAC可對抗一定的臭氧作用（圖1③）。

圖1 臭氧處理對Hela細胞增殖的影響

2.2 臭氧引起Hela細胞內ROS升高

臭氧處理后，Hela細胞內ROS水平顯著升高，而NAC預處理后ROS水平與空白組和NAC處理組差異無統計學意義，見圖2。

圖2 臭氧處理對Hela細胞內ROS的影響

2.3 臭氧抑制Hela細胞遷移

劃痕實驗分析顯示，臭氧處理后Hela細胞的傷口愈合能力（代表遷移能力）均受到抑制，且在12 h、24 h時點差異均有統計學意義（圖3①②）；Transwell實驗結果顯示，臭氧抑制Hela細胞遷移能力與劃痕實驗一致（圖3③④）。

圖3 臭氧處理對Hela細胞遷移的影響

2.4 臭氧抑制Hela細胞NF-κB信號通路表達

臭氧處理結果顯示，Hela細胞NF-κB和κB抑制性蛋白激酶（IKK）α表達及其磷酸化水平均降低，同時EMT相關波形蛋白（vimentin）和β-連環蛋白（catenin）表達水平降低，見圖4。此外，NAC預處理細胞可在一定程度防止臭氧誘導NF-κB信號通路蛋白和EMT相關蛋白vimentin和β-catenin表達降低。

圖4 臭氧對Hela細胞NF-κB信號通路和EMT相關蛋白的影響

3 討論

臭氧對部分癌細胞有抑制增殖效果的機制尚不明確。本研究顯示臭氧對宮頸癌Hela細胞氧化應激發生了作用，導致ROS在細胞內聚集，使細胞內NF-κB信號通路和EMT相關蛋白發生改變，表現為增殖和遷移受到抑制。

臭氧是臭氧發生器利用醫用純氧電離產生的臭氧-氧氣混合氣體［12］。臭氧在介入治療領域已取得廣泛應用，如治療缺血性疾病、炎癥疾病和癌癥［10，13-14］。有研究報道臭氧可對膀胱癌［15］、腺癌［16］和膠質母細胞瘤［17］有間接作用，能抑制其進展。本實驗發現臭氧處理后，Hela細胞內ROS有明顯增加。ROS是氧活性形式，其過量產生可導致大分子氧化，引起DNA突變和細胞死亡［18］；ROS積累會抑制NF-κB表達［7］。研究結果顯示NF-κB信號通路在多種腫瘤如宮頸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等進展中發揮重要作用［19］；NF-κB激活與腫瘤細胞生存、增殖、血管生成、擴張和轉移相關［20］；臭氧可能是潛在的NF-κB抑制劑［21］。因此，臭氧通過增加ROS產生增加氧化應激抑制NF-κB表達，可能是一種潛在的治療策略。

EMT是各種癌癥進展期一至關重要的事件，與腫瘤侵襲和轉移密切相關。研究證實多種實體腫瘤在發生侵襲和轉移的同時，常伴有腫瘤細胞EMT［22］。Vimentin是EMT中重要因子，屬間質源性，在正常細胞中表達量低或不表達，而在許多上皮腫瘤中高表達，是間質細胞遷徙的重要調節者，在肝癌、胃癌等惡性腫瘤中均能直接促進腫瘤侵襲、轉移，其表達量與腫瘤預后呈負相關［23-24］。β-catenin是一種多功能可溶性蛋白，介導體內許多生物過程，包括細胞增殖、黏附、分化等，在正常組織和良性上皮腫瘤中維持低水平，而在惡性腫瘤中表達陽性率可達50%以上，其表達量與腫瘤細胞侵襲轉移能力呈正相關［25-26］。本研究顯示臭氧處理后vimentin和β-catenin表達降低，提示臭氧影響細胞增殖遷移可能與影響EMT相關蛋白有關。

綜上，醫用臭氧可能通過抑制NF-κB信號通路下調vimentin、β-catenin抑制宮頸癌Hela細胞增殖和遷移，ROS在其中發揮重要作用，表明醫用臭氧有望成為宮頸癌新的輔助治療手段。