米卡芬凈中間體FR901379的分離純化技術研究

朱海，荀順義，劉慶，單繼軍(博瑞生物醫藥泰興市有限公司，江蘇 泰州 225400)

0 引言

采用分離純化技術能夠較為快速地實現物質成分分解，切實提高藥物活性。但是分離純化技術的應用成本和技術要求較高，而不同的分離純化技術具有不同的應用特點，具體應用效果也存在差別，較為常見的分離純化技術包括高效液相色譜、親和色譜。

1 米卡芬凈

米卡芬凈作為一種新型抗真菌藥，最早于2002年日本開始上市，米卡芬凈作用機制獨特，本身并無腎毒性，和其他藥物一起彼此之間并不會發生相互作用，因而被廣泛應用于治療危重患者侵襲性真菌病。自2005年美國 FDA 審批通過后，米卡芬凈的耐藥性備受關注。而米卡芬凈在臨床應用中，對熱帶念珠菌、杜氏念珠菌、白念珠菌均具有較好的抗菌效果。米卡芬凈屬于半合成抗菌藥，中間體FR901379是合成該藥物的關鍵材料，對中間體FR901379進行微生物轉化切除，再通過化學合成反應，與活性側鏈結合，即可獲得米卡芬凈。在米卡芬凈中間體FR901379的制備中，表現出流程復雜、使用材料多的特點，分離純化難度較高，難以實現中間體FR901379的量化生產，影響米卡芬凈的推廣應用。基于疊縮工藝原理，本試驗主要運用大孔樹脂，從而直接完成發酵液產物的分離、富集工作，并通過使用相應溶劑完成結晶分散，從而獲取得到高濃度的提取液，切實完成生物轉化，滿足生產需求，用于工業化生產。在試驗中，通過高效純化措施，將中間體FR901379轉變為米卡芬凈的高純度母核FR179642，以此為米卡芬凈的高效生產提供高質量原材料。

2 分離純化

分離純化試驗應用儀器包括高效液相色譜儀、水環真空泵及旋轉蒸發器；應用材料包括中間體FR901379發酵液、大孔樹脂(型號為D312、LX-18、HZ816、LX-20等)、乙腈等。

2.1 色譜條件

事實上，色譜條件也將會直接影響到試驗分析結構，對于本次試驗，流動相則采用乙腈∶4 g/L乙酸銨溶液 (47∶53)，將流速控制在1.0 mL/min左右，而整個色譜柱則選擇為Inertsil C 18 柱 (4.6 mm×250 mm，5 m)，柱溫始終保持在大約40 ℃[1]。如果溫度過低，將會促使流動相的粘度增加，影響后續試驗工作的展開。色譜柱的進樣量為10 μL，將色譜檢測波長設置為220 nm。

2.2 大孔樹脂的預處理

大孔樹脂是一種應用較為廣泛的有機高分子聚合物，具有液體吸附的功能，常溫狀態下理化性質較為穩定，但一旦將其處于可吸收溶劑很容易出現膨脹現象。大孔樹脂的使用類別多樣，當技術人員展開預處理工作時，便需要準備好各種型號的樹脂，將其放置到乙醇中進行浸泡，浸泡時間大約24 h。通過浸泡，可以直接通過乙醇的作用，將大孔樹脂中的各種雜質、色素去除。之后，再將其放置到去離子水中，添加乙醇進行洗滌，直到整個溶液并無白色渾濁現象出現，則表示大孔樹脂清理干凈。最后還需要先后將其放置到鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液調節酸堿度。需要注意的是，整個酸堿度調節過程，鹽酸和氫氧化鈉均為規格2 mol/L、含量3倍樹脂體積、浸泡時長4 h。

2.3 發酵液預處理

發酵液經過減壓、抽濾，獲取得到菌絲體，并在其中添加工業乙醇進行充分攪拌，浸泡時長為2 h，從而抽濾獲取得到浸提液。需要注意的是，由于提取乙醇自身濃度較高，并不利于后續展開樹脂吸附工作，這就需要工作人員能夠在發酵液中添加一定含量的去離子水進行調節，等到浸提液乙醇濃度處于40%左右后便可以完成整個發酵液的預處理工作。

2.4 樹脂靜態篩選

整個處理環節，可以將5 mL的樹脂放置到錐形瓶中，添加浸提液進行震蕩，從而達到吸附飽和的作用，進行濃度計算。過濾階段，將樹脂防治到錐形瓶中，添加100 mL的80%乙醇溶液，在室溫環境下進行充分震蕩，解吸4 h左右，從而完成解吸率的計算。其中，靜態飽和吸附量可以通過以下公式計算：

式中：c0為米卡芬凈中間體FR901379浸提液的起始濃度；ce為上清液中米卡芬凈中間體FR901379濃度；c1為解吸液中米卡芬凈中間體FR901379濃度；V0、Vt、V1則分別為浸提液體積、解吸液體積、吸附樹脂濕體積。

根據具體計算可以發現，對于不同類型樹脂的靜態飽和吸附量和解析率都存在差別，以D303為例，吸余液顏色為淺黃色，靜態飽和吸附量為0.6 mg/mL，解吸率達到49.8%，具有較為明顯的色素雜質吸附作用，可以用于當做脫色樹脂。

2.5 脫色樹脂的動態篩選

對于脫色樹脂的動態篩選，則可以選擇應用自身脫色效果較好的樹脂D303、HZ801，將其放置到具體規格為100 mL的玻璃柱中，并將流速控制在2 BV/h，從而將含 40%乙醇的浸提液上柱，進行流穿液的收集，對流穿液顏色進行對比，從而判斷樹脂脫色效果。結果表明，對于D303 樹脂，當流穿液處于 40 BV時，整體脫色效果較好，而當處于50 BV時，顏色將會再次變成黃色，到了80 BV，脫色效果最差，樹脂呈現為褐色。

2.6 樹脂的動態吸附試驗

2.6.1 動態吸附

對于已經經過前期處理的 LX-18 樹脂，可以直接將其放置到規格為100 mL的玻璃柱中，并將米卡芬凈中間體FR901379脫色液直接進行上柱動態吸附，整體流速需要控制在2 BV/h，從而結合流出液信息，獲取LX-18 樹脂的動態吸附情況。通常而言，對于前10 BV的流出液，可以直接按照集中收集的原則進行裝瓶，后10 BV的流出液，則可以按照單獨收集的原則，每1 BV流出液就需要將其單獨裝入到一個玻璃瓶。進而測定濃度，從而發現，當對濃度處于0.8 mg/mL 的米卡芬凈中間體FR901379脫色液展開動態吸附，流出液上樣量達到 15 BV，整體開始出現泄漏情況，而當流出液上樣量達到18 BV，流出液濃度和上樣液濃度基本趨同，表明樹脂動態吸附處于飽和狀態。

2.6.2 吸附流速

將已經經過前期預處理的 LX-18 樹脂再分別裝入到5個玻璃柱中，玻璃柱容積為100 mL。從而將動態篩選中獲取得到的米卡芬凈中間體FR901379脫色液上樣吸附，并將5根玻璃柱設置為不同的流速，按照每200 mL的含量，進行流出液的收集，進而檢測濃度，計算泄漏率，獲取最佳吸附流速[2]。

結果根據試驗表明，隨著上柱流速的提高，泄漏率也會相應提高，隨著上柱流速的下降，泄漏率也會相應降低，進而達到理想的吸附效果。事實上，對于米卡芬凈中間體FR901379，整個樹脂吸附過程均可以被看做是一個穩態過程，所以無論溶質在怎樣的環境完成擴散和吸附，均需要相應的傳質時間，速度則變成把控吸附率的重要因素。需要注意的是，隨著降低上柱流速能夠降低泄漏率，但當流速過慢時，也會嚴重影響整個生產周期，促使雜質增加，起到適得其反的效果。一般來講，可以將吸附流速控制在 1.5 ～ 2 BV/h范圍內。

2.6.3 吸附條件

同時選擇 D303 樹脂柱、 LX-18 樹脂柱，具體規格為50 mL、100 mL，將二者串聯，將流速控制在2 BV/h，從而完成上樣吸附。當出口濃度約為上樣濃度的10%左右，則初步判斷樹脂吸附已達到飽和狀態。按照2 BV/h的流速，用水將樹脂柱清洗干凈，特別是殘留料液，避免料液影響整個解吸效果。

之后，直接斷開D303 樹脂柱，并通過不同濃度的乙醇溶液進行LX-18樹脂柱的吸附，解吸流速控制在0.5 BV/h，從而按照分瓶收集的原則進行解吸液收集。應用 HPLC 法，并將所有濃度超過 0.2 mg/mL 的解吸液進行綜合處理，完成解吸率的計算。通過計算發現，當乙醇濃度為40%時，就可以將樹脂柱中多余色素清理干凈，但是清理效果有限；當乙醇濃度為60%時，解吸率達到71.5%，但是色素清理效果一般；當乙醇濃度為70%時，解吸率為85.7%，拖尾嚴重，當乙醇濃度為80%時，HPLC純度達到80.2%，解吸率為93.1%，整體解吸效果最好[3]。

2.7 選擇結晶溶劑

在解吸處理后，對溶液進行減壓濃縮處理，直到溶液濃縮為固體；再使用200 mg/mL 的80%乙醇溶液溶解固體，將溶液濃度劃分為3份，并分別添加異丙醚析晶、乙酸乙酯、丙酮，添加量為溶解液的8～10倍體積，將潔凈液冷卻放置24 h，要求冷卻溫度控制在2～8 ℃，冷卻后進行抽濾干燥處理，可獲得中間體FR901379的粗粉產品，通過HPLC法進行產品濃度檢測，從而發現將丙酮作為分散結晶的溶劑結晶收率較好，為81.4%，異丙醚析晶的結晶收率為70.2%，乙酸乙酯的結晶收率為66.3%，均低于丙酮。

2.8 試驗驗證

基于上述試驗獲取得到的分離純化條件，對吸附樹脂 LX-18 分瓶展開工藝驗證，設置三種不同濃度的浸提液與解吸液，從而檢測發現，提取總收率始終大于70%，能夠完成理想的分離純化生產效果。就此，在米卡芬凈生產中，可利用疊縮工藝進行中間體FR901379的分離純化，提高中間體FR901379的總收率，實現米卡芬凈生產的降本增效目的，可在實際生產中推廣普及。

3 結語

綜上所述，對米卡芬凈中間體FR901379的分離純化技術展開分析具有至關重要的意義。通過試驗發現，選擇濃度80%的乙醇、丙酮分別作解吸劑、結晶溶劑，并將吸附流速控制在1.5 ～ 2 BV/h范圍，能夠取得理想的分離純化效果。