慢性乙型肝炎患者CD4+Th細胞中LSD1表達及其作用

毛 雪， 陳志勇， 顧宇峰， 朱雪娟， 譚曉慧*， 汪曉鶯， 朱軼晴， 湯 偉

1. 南通大學附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科，南通 226001 2. 南通大學附屬醫(yī)院感染科，南通 226001 3. 南通大學醫(yī)學院免疫系，南通 226001

目前一致認為，乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染的機制涉及病毒和機體免疫功能兩方面，后者占主要地位[1-2]。HBV感染后，體內輔助性T淋巴細胞(Th細胞)增殖、分化及各亞群尤其是Th1/Th2之間的平衡狀況，直接或間接影響乙型肝炎的發(fā)病狀況及轉歸。各型乙型肝炎患者體內均存在明顯的細胞免疫應答失衡。急性乙型肝炎以Th1類細胞應答占優(yōu)勢，上升的Th1 類細胞因子[白細胞介素2(IL-2)、干擾素γ(IFN-γ)等]促進細胞毒性T淋巴細胞(CTL)參與清除HBV；慢性乙型肝炎(CHB)則以Th1類細胞應答下降為主，Th1類細胞因子表達下調，Th2類細胞因子表達上調，細胞免疫應答減弱，而Th1/Th2類細胞免疫應答失衡可能是HBV 感染慢性化的重要機制之一[3-4]。

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(histone lysine-specific demethylase 1，LSD1)具有特異性去除單甲基化和二甲基化 H3K4 和 H3K9 位點上的甲基基團的功能。LSD1在淋巴細胞分化中發(fā)揮作用，參與維持Th1/Th2細胞分化平衡。張潔等[5]的研究顯示，在體外可通過降低LSD1 活性誘導Th1/Th2 細胞分化偏向Th1 細胞，Th1類細胞因子表達上調，Th1類細胞免疫應答水平增強。但是，目前未明確CHB患者體內LSD1的表達是否與其Th1類細胞因子表達下調、Th2類細胞因子表達上調致Th1 /Th2類細胞免疫應答失衡有關。

因此，本研究通過觀察CHB患者外周血CD4+Th細胞中LSD1的表達水平，分析其與血清中IFN-γ、IL-4、丙氨酸轉氨酶(ALT)、乙肝病毒載量(HBV-DNA)等指標的相關性，探討LSD1表達與Th1、Th2細胞免疫的關系，以了解LSD1介導的組蛋白修飾在HBV感染慢性化機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年6月至12月在南通大學附屬醫(yī)院感染科住院的65例CHB患者，均依據(jù)慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)[6]診斷。65例CHB患者中，男性41例、女性24例，年齡18～65歲，平均(43.32±12.38)歲。所有患者均排除甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染及應用相關藥物、酒精或自身免疫性疾病等引起的急慢性肝損害，均未接受過抗HBV藥物、糖皮質激素或胸腺肽等免疫調節(jié)劑的治療。另選擇30例同期于本院接受健康體檢的健康人作為對照，男性18例、女性12例，年齡22～63歲，平均(44.43±11.74)歲。對照組均無病毒性肝炎及自身免疫性疾病病史，肝功能正常，HBV標志物陰性，HCV抗體陰性。2組研究對象性別構成與年齡差異無統(tǒng)計學意義。

根據(jù)CHB患者入院時的ALT水平將65例患者分為ALT高水平組[>4×ULN(正常上限)]與ALT低水平組(≤4×ULN)；按HBV-DNA定量結果，將65例患者分為HBV-DNA高載量組(≥106拷貝/mL)與HBV-DNA低載量組(<106拷貝/mL)。

1.2 主要試劑及儀器 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)測定試劑盒購自美國雅培公司；HBV-DNA熒光定量試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司)；人IFN-γ和 IL-4 ELISA檢測試劑盒購自北京欣博盛生物科技有限公司)。CD4+Th細胞陽性分選試劑盒(含試劑A和試劑B)購自美國Dynal公司。人CD3-FITC、CD4-PE單抗購自美國BD公司；兔抗人β-actin 抗體購自美國Bioworld Technology公司；兔抗人LSD1單克隆抗體購自美國CST公司；HRP 標記羊抗兔抗體購自美國Bioworld Technology公司。ECL化學發(fā)光試劑購自美國Pierce公司。全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司。

全自動蛋白質核酸定量檢測儀購自德國Eppendorff公司。MACS磁力架購自美國Dynal公司。化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Chemi-Smart 5000)購自法國Vilber公司。RG3000熒光定量PCR系統(tǒng)購自德國Rotor-Gene公司。i200SR型全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析儀購自美國雅培公司。

1.3 外周血CD4+Th細胞LSD1檢測 采集受試者空腹靜脈血4 mL(EDTA-Na2抗凝)，常規(guī)分離出單個核細胞，采用免疫磁珠法分選出CD4+Th細胞，以流式細胞術檢測其純度，≥95.0%時用于后續(xù)研究。提取CD4+Th細胞總蛋白，以Western 印跡法檢測LSD1蛋白表達：SDS-PAGE電泳，轉膜，先后加入一抗(兔抗人LSD1抗體及兔抗人β-actin抗體)和二抗(HRP標記羊抗兔抗體)孵育，ECL發(fā)光化學試劑處理后，置于Chemismart 5000，用Image J分析軟件測定目標條帶的灰度值。以LSD1/β-actin的灰度比值表示LSD1蛋白的相對含量。

1.4 血清CHB指標、免疫指標檢測 血清HBsAg定量采用全自動微粒子化學發(fā)光法，按試劑盒說明書操作。血清HBV-DNA定量檢測采用實時定量PCR法，按試劑盒說明書操作。HBV-DNA最低檢測限1 000/mL，各標本實際檢測值取常用對數(shù)，以log10表示。血清IFN-γ、IL-4定量檢測采用ELISA法，按試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 CHB患者與健康人外周血CD4+Th細胞LSD1表達水平比較 結果(圖1)顯示：CHB患者CD4+Th細胞LSD1表達量(0.28±0.09)高于健康人(0.52±0.21；t=-7.49，P< 0.001)。

圖1 外周血CD4+Th細胞LSD1蛋白表達情況

2.2 各亞組CHB患者外周血CD4+Th細胞LSD1表達量比較 結果(表1)顯示：CD4+Th細胞LSD1表達量在ALT高水平組低于ALT低水平組(P<0.001)，在HBV-DNA高載量組高于低載量組(P<0.001)。

表1 各亞組CHB患者CD4+Th細胞LSD1表達量

2.3 CHB患者與健康人血清IFN-γ、IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值比較 ELISA結果(表2)顯示：CHB患者血清IFN-γ含量及IFN-γ/IL-4比值均低于健康人(P<0.05)，IL-4含量高于健康人(P=0.001)。

表2 CHB患者與健康人血清IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4水平

2.4 CHB患者LSD1表達量與血清ALT、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4及HBV-DNA載量的相關性分析 結果(表3)顯示：CHB患者外周血CD4+Th細胞LSD1表達量與血清ALT水平、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4負相關(P<0.01)，與HBV-DNA載量正相關(P<0.001)，與血清IL-4水平無相關性。

表3 LSD1表達量與血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4及HBV-DNA載量的相關性

3 討 論

LSD1定位于細胞核內，能特異性脫去染色體組蛋白H3K4、H3K9、H3K27等位點上的單甲基化和二甲基化甲基基團，對靶基因的表達產(chǎn)生不同影響[7-9]。

LSD1在CD4+T淋巴細胞分化中發(fā)揮重要作用，參與維持Th1/Th2分化的平衡。T-bet是Th1細胞相關的轉錄因子，影響Th1細胞的分化及Th1反應[10]。CD4+T細胞分化為Th1過程中，LSD1可通過影響T-bet啟動子區(qū)域的H3K27和H3K4的甲基化，使T-bet轉錄降低或失活，從而影響Th1/Th2的平衡狀態(tài)[11-12]。本研究中，CHB患者CD4+Th細胞中LSD1表達量較健康人升高；在CHB患者中，ALT低水平組CD4+Th細胞LSD1表達量高于ALT高水平組，HBV-DNA高載量組CD4+Th細胞LSD1表達量高于HBV-DNA低載量組。

近年來免疫學研究表明，Th1/Th2細胞反應在機體細胞免疫中發(fā)揮非常重要作用。慢性HBV攜帶者、CHB及乙肝肝硬化患者的血清Th1細胞因子(如IFN-γ、IL-2、IL-12水平低于健康人群，而Th2細胞因子IL-4水平高于健康人，IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值與HBV-DNA載量負相關[13-15]。另有研究[16]發(fā)現(xiàn)，降低小鼠體內LSD1表達，可明顯提高血清中IFN-γ水平。本課題組前期研究[17]中以HBV感染小鼠為模型，給予LSD1抑制劑反苯環(huán)丙胺(TCP) 及LSD1的siRNA抑制LSD1的活性后，在相同時間段內，血清中HBsAg水平、HBV-DNA載量均明顯降低，且肝組織中HBsAg明顯減少。本研究中，與健康人比較，CHB患者血清IFN-γ含量減少、IL-4含量增加、且IFN-γ/IL-4比值降低，提示CHB患者體內Th1/Th2平衡偏向Th2；進一步分析發(fā)現(xiàn)，CHB患者CD4+Th細胞LSD1表達量與血清IFN-γ及IFN-γ/IL-4負相關，與IL-4無相關性，而與HBV-DNA定量正相關。本研究結果與上述研究相符。

綜上所述，CD4+Th細胞LSD1參與調節(jié)機體Th1/Th2細胞免疫平衡。CHB患者CD4+Th細胞內LSD1表達升高可引起Th1細胞分化減少和Th1/Th2反應失衡，導致機體對HBV清除及抑制HBV復制的能力降低，表現(xiàn)為CHB患者CD4+Th細胞LSD1高表達時，其血清IFN-γ水平降低，肝臟組織炎癥較輕和血清HBV-DNA載量升高。本研究提示，CD4+Th細胞LSD1表達升高可能是HBV感染慢性化的機制之一。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。