PROX1通過上皮間質轉化促進非小細胞肺癌進展

高 健， 敖永強， 張領先， 王 帥， 丁建勇*， 蔣家好*

1. 復旦大學附屬中山醫院胸外科，上海 230032 2. 南昌大學第二附屬醫院胸心外科，南昌 330006

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤，同時也是腫瘤相關死亡的首要原因，每年約造成200萬例患者死亡[1]。臨床上通常把肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中NSCLC約占85%[2]。盡管近幾年肺癌的診斷和治療方法取得很大進步，但由于其早期轉移和高復發率，患者的5年生存率只有約20%[3-4]。因此，尋找準確可靠的標志物對于肺癌的早期診斷和治療，以及改善患者預后具有重要意義。

轉錄因子Prospero同源框1(Prospero-related homeobox 1，PROX1)是果蠅Prospero的同源物，可調節多種器官的發育[5]。最近的研究[6-10]表明，PROX1在多種腫瘤中發揮作用，但在不同類型的腫瘤中，其對腫瘤生物學行為的影響具有較大差異。PROX1在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中發揮抑制作用，而在結直腸癌、腦膠質瘤等惡性腫瘤中發揮促癌作用。然而，PROX1在NSCLC發生發展中的作用以及對預后的影響仍不清楚。本研究將進一步探究PROX1對NSCLC生物學行為的影響及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 研究樣本 收集2014年6月至2015年7月在復旦大學附屬中山醫院接受標準的108例肺葉切除術和縱隔淋巴結清掃術患者的108對NSCLC腫瘤和相應的癌旁組織，用于制作組織芯片。患者相關臨床病理資料均從復旦大學附屬中山醫院數據庫中獲得，最后一次隨訪時間為2020年5月。本研究已通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審查(Y2019-187)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 細胞培養及轉染 NSCLC細胞系A549細胞購買于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，培養條件：DMEM培養基+10%胎牛血清+1%雙抗，于37℃含5%CO2的培養箱培養。病毒轉染：PROX1敲減的慢病毒由上海吉滿生物公司合成。敲減的序列：shPROX1-1為5′-TTT CCA GGA GCA ACC ATA ATT- 3′; shPROX1-2為5′-GGC TCT CCT TGT CGC TCA TAA- 3′。轉染時將細胞重懸計數后以2×105個/孔的密度鋪在6孔板內，放入培養箱中培養24 h，然后加入含有1×106TU/mL病毒的培養基3 mL，再加入5 μg/mL的polybrene，繼續培養24 h后倒掉培養基，加入新的培養基，繼續培養48 h后檢測PROX1蛋白表達情況。

1.3 免疫組化染色 組織芯片由上海芯超公司制作完成，組織芯片于60℃烘烤3 h，用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脫蠟后，用梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)水化。后用過氧化氫孵育30 min，檸檬酸鈉修復高火15 min，山羊血清封閉1 h后加入PROX1一抗(1∶500，Abcam公司，英國)，4℃過夜后用辣根過氧化物酶孵育1 h后DAB染色，顯微鏡觀察染色深度至合適時終止顯色。蘇木精復染40 s，水洗20 min，然后逆乙醇梯度脫水，二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ各浸泡5 min后晾干，中性樹脂封片。免疫組化評分標準：染色強度(0，未染色；1，輕度染色；2，中度染色，3，強染色)以及染色密度(1，≤25%；2，26%～50%；3，51%～75%；4，>75%)。最終評分為染色強度+染色密度，得分≥4被定義為PROX1高表達組，得分≤3被定義為PROX1低表達組。

1.4 qRT-PCR 采用碧云天RNA提取柱提取RNA后，采用NanoDrop 2000測定RNA濃度并用逆轉錄試劑盒(翌圣生物科技股份有限公司，中國)將其反轉錄為cDNA。溫度條件：5 min，25℃；30 min，42℃；5 min；85℃。而后使用PCR儀(Applied Biosystems)進行RT-qPCR。反應條件：95℃，10 s；55～60℃，20 s；72℃，20 s，共40個循環。PROX1引物序列：F為CCC GTT ATG CCA GCT CCA ATA；R為CGT GCG TAC TTC TCC ATC TGA A。GAPDH引物序列：F為TCA GCA ATG CCT CCT GCA C; R為TGG CAT GGA CTG TGG TCA ATG。E-cadherin的引物序列：F為GAA CGC ATT GCC ACA TAC AC；R為GAA TTC GGG CTT GTT GTC AT。Vimentin的引物序列：F為TTG CCG TTG AAG CTG CTA ACT ACC；R為AAT CCT GCT CTC CTC GCC TTC C。

1.5 Western印跡法檢測 采用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白后，BCA法測定蛋白濃度，統一調整為4 μg/μL。蛋白上樣后進行電泳(150 V，60 min)，而后進行轉膜(0.28 mA，1.5 h)，將蛋白轉移至PVDF膜上，快速封閉液封閉20 min后一抗孵育(1∶1000)，4℃搖晃過夜，第2天用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，ECL發光顯影。

1.6 Transwell實驗

1.6.1 遷移實驗 細胞用無血清培養基重懸，向小室上層加入5×104個細胞，總體積為200 μL，下層加入正常培養基500 μL，37℃培養箱培養24 h，后用4%多聚甲醛固定，1%結晶紫溶液染色，顯微鏡下拍照計數。

1.6.2 侵襲實驗 小室上層鋪入60 μL(按1∶8稀釋)基質膠后，放入37℃培養箱中培養30 min。細胞用無血清培養基重懸后，向小室上層加入1×105個細胞，約200 μL，下層加入正常培養基500 μL，37℃培養箱培養48 h，后用4%多聚甲醛固定，1%結晶紫溶液染色，顯微鏡下拍照計數。

1.6.3 CCK-8實驗 細胞重懸計數后，96孔板內每孔加入1 000個細胞，總體積為100 μL，孵育7 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續37℃培養2 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度，后每24 h測1次，連測4 d。

2 結 果

2.1 PROX1在NSCLC中的表達 結果(圖1)顯示：在108例NSCLC患者中，有55例(50.9%)腫瘤組織中PROX1高表達，并且在腫瘤中的表達高于對應的癌旁組織。

圖1 PROX1在NSCLC及癌旁中的表達

2.2 PROX1高、低表達組的一般資料分析 結果(表1)顯示：腫瘤直徑和淋巴轉移在PROX1高低表達組間差異有統計學意義(P=0.003、0.042)，其他指標差異無統計學意義。

表1 PROX1高、低表達組的一般資料分析 n(%)

2.3 PROX1高、低表達組的預后分析 結果(圖2)顯示，高表達PROX1的NSCLC患者其5年復發率高于PROX1低表達組(70.9%vs50.9%，P=0.005)，而5年生存率低于PROX1低表達組(49.1%vs66%，P=0.016)。

圖2 PROX1高表達組和低表達組的復發和生存比較的生存曲線

2.4 NSCLC患者的預后Cox單因素和多因素分析 結果(表2、表3)顯示，淋巴轉移和PROX1的表達是影響NSCLC患者術后腫瘤復發和死亡風險的獨立影響因素(P<0.05)。

表2 NSCLC術后復發相關Cox單因素和多因素分析

表3 NSCLC患者術后生存相關Cox單因素和多因素分析

2.5 PROX1對NSCLC細胞的增殖、侵襲和轉移作用 在A549細胞系中構建了PROX1敲減模型，并且Western印跡法證實了PROX1在A549細胞系中被成功敲減(圖3A)。CCK-8實驗結果(圖3B)表明，敲減PROX1后NSCLC細胞的增殖能力明顯減弱(P<0.01)。Transwell實驗結果(圖3C)表明，敲減PROX1后NSCLC細胞的侵襲和遷移能力明顯減弱(P<0.05)。因此，通過以上功能實驗發現，PROX1能夠促進NSCLC細胞的增殖、侵襲和轉移。

圖3 體外驗證敲減PROX1對腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

2.6 PROX1對NSCLC的EMT變化的影響 Western印跡法和qRT-PCR結果(圖4A、4B)表明，當敲減A549中的PROX1后，A549中的E-鈣黏著蛋白(E-cadhein)表達明顯升高而波形蛋白(vimentin)明顯降低(P<0.001)。證實PROX1可誘導NSCLC的EMT變化，從而導致腫瘤進展。

圖4 敲減PROX1后NSCLC中EMT標志物表達的變化

3 討 論

目前有關PROX1在腫瘤發生發展中作用的研究很多[6-7, 9-10]。既往研究[11-12]顯示，PROX1在肝癌、前列腺癌等多個類型的腫瘤中促進腫瘤的發生和發展，但是其在NSCLC中的臨床意義仍不明確，并且PROX1在NSCLC中相應的功能和機制也有待進一步探究。因此，本研究首次明確了PROX1在NSCLC中的功能和相關分子機制。通過對NSCLC患者的組織芯片進行PROX1免疫組化染色發現，在部分NSCLC患者中PROX1高表達，并且高表達PROX1的NSCLC患者其生存預后較低表達組差。進一步通過功能實驗證實了PROX1可以促進NSCLC的增殖、侵襲和轉移。在機制方面發現，EMT在PROX1參與NSCLC進展中發揮著重要作用。

EMT是指從上皮細胞向間質細胞的表型轉變[13]。既往文獻[14]報道，EMT在胚胎發育、組織修復與纖維化以及腫瘤發生發展中發揮重要作用，腫瘤細胞通過EMT變化顯著增強了其增殖、侵襲和轉移能力。當上皮細胞通過EMT獲得向周圍侵襲轉移能力的同時，細胞會部分喪失上皮標志物，如E-鈣黏著蛋白，并獲間質標志物，如波形蛋白，因此這2個蛋白也是檢測腫瘤EMT變化的重要標志物[15]。根據既往文獻[16]報道，EMT也是NSCLC發生發展過程中的重要機制，并且研究廣泛。在肝細胞肝癌、結直腸癌、前列腺癌等腫瘤中已經有很多關于PROX1通過促進EMT促進腫瘤進展的機制研究[11-12, 17]，并且報道顯示，PROX1也是預測腫瘤復發轉移的重要標志物。PROX1過表達的細胞中，波形蛋白表達升高而E-鈣黏著蛋白表達下降；當下調PROX1的表達時，E-鈣黏著蛋白表達上調而波形蛋白表達下降[10-12,18]。這與本研究結果一致，本研究中敲減NSCLC中的PROX1時，E-鈣黏著蛋白的表達升高而波形蛋白的表達明顯下降。因此，PROX1可能通過EMT過程促進NSCLC的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，PROX1的表達與NSCLC的惡性程度相關，高表達PROX1的NSCLC患者預后更差，PROX1主要通過EMT促進NSCLC的進展。PROX1可能作為判斷NSCLC預后的可靠預測因子，同時也是潛在的治療靶點。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。