懷玉山三葉青查爾酮合酶基因克隆和表達分析

洪森榮，劉佳，劉軍，劉依婷，陳榮華，蔡紅

（1.上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001；2.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室/上饒市三葉青保育與利用技術創新中心/上饒農業技術創新研究院，江西 上饒 334001；3.上饒市紅日農業開發有限公司，江西 上饒 334700）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又名金絲吊葫蘆，葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬植物，是我國特有珍稀藥用植物，也是民間常用藥，主要分布在我國的浙、贛、湘、閩、粵、滇、桂、川等地區［1］。三葉青性寒味苦，具有祛風化痰、活血散結、消炎止痛和清熱解毒等功效，以地下塊莖和果實的藥用效果最好［2］?，F代藥理實驗和臨床應用表明，三葉青無毒、無副作用、無耐藥性，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎解熱、鎮痛保肝以及免疫調節等多種藥理作用，被譽為“植物抗生素”［3］。

黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產物，不但能抗毒、調節生長、清除活性氧、抵抗紫外輻射，還能抗氧化、抗腫瘤、調節機體免疫力、清除自由基［4］。查爾酮合酶（CHS）是黃酮類化合物生物合成過程中第一個限速酶和關鍵酶，主要催化丙二酰輔酶A和對羥基苯丙烯酰輔酶A縮合生成異黃酮、黃酮醇、黃烷酮和花青素等物質的共同前體查爾酮，從而為合成黃酮類化合物提供基本碳鏈骨架［5］。查爾酮合酶對植物生長發育的某些生理過程，如花色形成、根瘤形成、生物和非生物脅迫響應、抵御紫外輻射傷害等，具有重要作用［6］。因此，克隆三葉青查爾酮合酶基因并進行qRT-PCR（實時熒光定量PCR）分析，對研究查爾酮合酶基因在三葉青中的表達和三葉青黃酮類化合物的合成機理具有重要意義。

關于查爾酮合酶研究的報道較多，如韓穎穎等［7］對蝴蝶蘭查爾酮合酶基因cDNA進行了克隆、鑒定和原核表達；謝修志等［8］對非洲菊查爾酮合酶基因進行了克隆、序列分析，并在大腸桿菌中表達；譚曉風等［9］對油茶查爾酮合酶和異構酶基因進行了cDNA克隆和序列分析；和鳳美和朱永平［10］構建了東方百合“元帥”查爾酮合酶基因的表達載體；吳琦等［11］對苦蕎查爾酮合酶基因的結構及花期不同組織表達量進行了分析；伍翀等［12］研究了黃芩查爾酮合酶基因內含子在轉基因煙草中對GUS活性的調控；汪結明等［13］對矮牽牛查爾酮合酶基因進行了生物信息學分析；李成磊等［14］對甜蕎查爾酮合酶基因進行了克隆和序列分析；夏芳等［15］研究了水母雪蓮查爾酮合酶基因的克隆、表達和活性；汪孟曦等［16］克隆了白木香的查爾酮合酶基因AsCHS1，并進行了生物信息學分析；李星和王紅［17］對虎杖查爾酮合酶基因PcCHS1進行了克隆與功能分析；劉姍等［18］克隆了金龍膽草查爾酮合酶基因并對其在花期不同組織中的表達進行了分析；王佳媛等［19］克隆了海南龍血樹查爾酮合酶基因DcCHS，并分析了其在花、根、莖、葉和果實中的表達量；齊宇和趙蘭勇［20］克隆了玫瑰查爾酮合酶基因，并對其進行了生物信息學分析；馬立功等［21］克隆了向日葵查爾酮合酶基因HaCHS，并對其逆境應答進行了研究；趙風治等［22］克隆了花椰菜的查爾酮合酶基因，并對其功能進行了分析；孟衡玲等［23］克隆了鐵皮石斛查爾酮合酶基因，并對其表達進行了分析；孫威等［24］克隆了日本蛇根草查爾酮合酶基因，并對其生物信息學進行了分析；潘德灼等［25］克隆了紅樹植物秋茄查爾酮合酶基因，并對其在鹽脅迫下的表達進行了分析；趙學榮等［26］克隆了苦蕎查爾酮合酶基因FtCHS1啟動子，并對其在低溫（4℃）和光照（UV-B）處理下的表達進行了分析；周姍等［27］克隆了烏拉爾甘草查爾酮合酶基因，并對其進行了序列分析；胡會剛［28］和徐僡［29］等分別對香蕉查爾酮合酶基因家族和金釵石斛的查爾酮合酶基因進行了生物信息學分析。

目前，對三葉青的研究主要集中在化學成分、藥理臨床、種植栽培、組織培養等方面［1，3］，關于三葉青查爾酮合酶方面的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR技術克隆了懷玉山三葉青查爾酮合酶基因，并采用生物信息學方法和qRTPCR進行序列分析和組織表達分析，可為揭示懷玉山三葉青查爾酮合酶的生物學功能提供理論依據，為從分子水平調控懷玉山三葉青黃酮醇成分代謝及體外催化合成黃酮醇提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷玉山三葉青2個栽培種‘懷玉1號’和‘懷玉2號’試管苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑提取懷玉山三葉青‘懷玉2號’試管苗的總RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，逆轉錄引物用Oligo（dT）18 Primer（5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3′），具體步驟按說明書進行。

1.2.2 查爾酮合酶基因的克隆 利用轉錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN16981_c0_g3），運用Primer Premier 5.0設計引物（F：5′-ATGGCGGCCACCATGACCG-3′；R：5′-TCATGCGGTTGCCCCGGCGGT-3′）。PCR擴增條件：95℃2 min；95℃30 s，62.8℃30 s，72℃30 s，35個循環；72℃10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體連接并用熱激法轉化到感受態細胞E.coliDH5α，經鑒定正確的陽性轉化子提取質粒送往上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.3 查爾酮合酶基因的生物信息學分析 使用BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用ProtParam預測酶的理化性質，用ProtScale預測酶的疏/親水性。使用GOR I軟件在線預測酶的二級結構。使用SWISS-MODEL在線預測酶的三級結構。采用WoLFPsort在線預測基因的表達部位。通過軟件DNAMAN和Bioedit進行氨基酸序列比對，利用MEGA 5.0軟件進行系統進化樹的構建。

1.2.4 查爾酮合酶基因的組織表達分析 分別取懷玉山三葉青2個栽培種‘懷玉1號’和‘懷玉2號’試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng，反轉錄為cDNA。qRT-PCR（SYBR Green I）檢測內參基因為GAPDH。設計引物F為5′-CACGAGTCCCACCTCGACTC-3′，R為5′-AGGGGACGCTCCACGGACA-3′，大小為104 bp，Tm為59.2。qRT-PCR檢測采用16μL反應體系（SYBR Green Mix 7μL，Primer-F 0.5μL，Primer-R 0.5 μL，cDNA 8μL），PCR反應程序：95℃10 min；95℃10 s，60℃34 s，95℃15 s，40個循環。使用2-△△Ct法計算基因表達水平。試驗重復3次。

試驗所有數據表示為平均值±標準差，并使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，應用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗查爾酮合酶基因組織表達的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因cDNA序列

懷玉山三葉青查爾酮合酶基因cDNA總長度為1 143 bp（圖1、圖2），G+C和A+T含量分別為65.27%和34.73%（圖3）。

圖1 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因PCR擴增

圖2 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因堿基組成

圖3 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因各堿基的比例

2.2 懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列

懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列見圖4。懷玉山三葉青查爾酮合酶由380個氨基酸組成，分子量41 809.23 Da，等電點6.19，為親水性蛋白。各氨基酸的數目和比例為Ala（A）37、9.7%，Arg（R）20、5.3%，Asn（N）9、2.4%，Asp（D）23、6.1%，Cys（C）7、1.8%、Gln（Q）12、3.2%，Glu（E）24、6.3%，Gly（G）30、7.9%，His（H）12、3.2%，Ile（I）18、4.7%，Leu（L）34、8.9%，Lys（K）22、5.8%，Met（M）17、4.5%，Phe（F）13、3.4%，Pro（P）17、4.5%，Ser（S）20、5.3%，Thr（T）20、5.3%，Trp（W）4、1.1%，Tyr（Y）9、2.4%，Val（V）32、8.4%。帶負電荷殘基（Asp+Glu）總數為47，帶正電荷殘基（Arg+Lys）總數為42。估計半衰期為30 h（哺乳動物網織紅細胞，體外），＞20 h（酵母，體內），＞10 h（大腸桿菌，體內）。失穩指數（II）為40.92，因此將該蛋白分類為不穩定蛋白。

圖4 懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列

2.3 懷玉山三葉青查爾酮合酶親疏水性分析

在圖5中，峰值（正值）區域表示疏水區域，而低谷區域（負值）是親水區域?？梢?，最大疏水值在2.25左右，說明該處的疏水性最強；親水峰值最大為-2.50左右。該蛋白整體表現出高度的親水性，為親水蛋白。

圖5 懷玉山三葉青查爾酮合酶親疏水值分布

2.4 懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級、三級結構分析

懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級結構預測結果（圖6）顯示，其二級結構由α-螺旋（Hh，37.37%）、β-片層（Ee，19.47%）、無規則卷曲（Cc，43.16%）構成，且無規則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個蛋白中（圖7）。

圖6 懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級結構預測結果

圖7 懷玉山三葉青查爾酮合酶二級結構各部分的分布

三級結構是多個二級結構元素在三維空間排列形成的，SWISS-MODEL預測顯示懷玉山三葉青查爾酮合酶的三級結構為二聚體（圖8）。

圖8 懷玉山三葉青查爾酮合酶三級結構

2.5 懷玉山三葉青查爾酮合酶的亞細胞定位

對懷玉山三葉青查爾酮合酶基因表達部位的預測結果（圖9）顯示，定位于細胞核中的數量為6，定位于線粒體中的數量為5，定位于細胞質中的數量為2，定位于細胞外的數量為1。表明其主要存在于細胞核和線粒體中。

圖9 懷玉山三葉青查爾酮合酶亞細胞定位

2.6 懷玉山三葉青查爾酮合酶系統進化分析

由構建的進化樹（圖10）可見，懷玉山三葉青查爾酮合酶與硬粒小麥（Triticum turgidumsubsp.durum）、節節麥（Aegilops tauschiisubsp.tauschill）、小麥（Triticum aestivum）的查爾酮合酶在一個大分支下，說明他們之間親緣關系較近，尤其是與硬粒小麥未命名蛋白產物VAH38240.1親緣關系最近。

圖10 懷玉山三葉青查爾酮合酶系統進化分析

2.7 懷玉山三葉青查爾酮合酶同源蛋白的序列比對信息

保守結構域是指在生物進化過程中不變或者一個蛋白家族中相同的結構域，一般具有重要的功能，不能被改變。圖11中“※”號區域即為懷玉山三葉青查爾酮合酶蛋白家族的保守結構域，可見其同源蛋白保守結構域較為豐富。懷玉山三葉青在15到32位點氨基酸缺失，在其他位點與硬粒小麥（Triticum turgidumsubsp.durum）、節節麥（Aegilops tauschiisubsp.tauschill）、小麥（Triticum aestivum）完全一致，說明懷玉山三葉青查爾酮合酶與硬粒小麥、節節麥、小麥的查爾酮合酶同源性較高。

圖11 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因氨基酸序列的同源性比較

2.8 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中查爾酮合酶基因的表達分析

由圖12可見，懷玉山三葉青查爾酮合酶基因在‘懷玉1號’和‘懷玉2號’栽培種根、莖、葉中均有表達，但表達量在不同器官間差異顯著，其中，根中表達量最高，葉中最低。

圖12 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中 查爾酮合酶基因相對表達量分析

3 討論

三葉青地下塊根中的藥用成分主要有黃酮、多糖及多酚等［1］，其中，黃酮類物質，如山奈酚蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮苷、兒茶素、紫云英苷等均具有藥理活性［3］。合成黃酮類化合物的關鍵酶之一是查爾酮合酶［5］。查爾酮合酶基因的突變、沉默或過表達會影響三葉青黃酮類物質的合成，對其功能和產量產生一定影響。因此，研究查爾酮合酶基因的結構和表達方式，將有助于明確三葉青黃酮合成的分子機制，提高三葉青中黃酮含量。

本研究從懷玉山三葉青中克隆到查爾酮合酶全長基因，cDNA總長度為1 143 bp，G+C含量為65.27%；該基因編碼的蛋白質具有查爾酮合酶家族保守存在的功能位點及結構域，由380個氨基酸組成，分子量41 809.23 Da，等電點6.19，是一種親水性、不穩定蛋白，與硬粒小麥（Triticum turgidumsubsp.durum）未命名蛋白產物VAH38240.1的親緣關系最近。研究表明，G+C的含量越高，基因穩定性越高［7-29］。懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的G+C含量大于50%，推測其處于相對穩定的狀態，有助于該基因在進化過程中穩定遺傳。此外，作為黃酮類化合物代謝途徑的第一個關鍵限制酶，懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的組織表達情況可能會對黃酮合成和累積造成影響，進而影響三葉青藥材的品質。本研究結果表明，該基因在懷玉山三葉青2個栽培種的根、莖、葉中均有表達，但器官間存在顯著差異，均以根中的表達量最高，葉中最低。本研究結果為進一步探究懷玉山三葉青查爾酮合酶的功能及表達調控奠定了理論基礎。

4 結論

懷玉山三葉青查爾酮合酶具有查爾酮合酶典型的結構特征，氨基酸序列及核苷酸序列與同源物種相似度高，在進化上高度保守，且懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的表達存在組織器官差異性，根中表達量最高。