谷子脂質轉移蛋白基因SiLTP1的克隆及表達分析

孟凡花，李臻，王慶國，劉煒

（1.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014；2.山東省農業科學院濕地農業與生態研究所，山東 濟南 250100）

脂質作為生物膜的主要組成成分，可通過形成疏水屏障將細胞與外界隔離，參與植物碳源和能量的儲存、保護組織的形成、信號傳導以及抵御病菌侵入等生理過程［1］。植物脂質轉移蛋白（lipid transfer protein，LTP）是高等植物中大量存在的一種小型堿性蛋白，能夠在體外可逆地結合并轉運脂肪酸、磷脂、糖脂等多種疏水分子。LTP家族在植物中普遍存在，在擬南芥、水稻、小麥、玉米、油菜等中均已鑒定到大量LTP編碼基因，其中在擬南芥和水稻全基因組中分別發現了79個和53個LTPs基因［2］，在玉米和油菜中分別發現了77個和63個LTPs基因［3，4］。最初，根據蛋白分子量的大小，主要將植物中的LTP分為兩類：LTPⅠ型和LTPⅡ型［5］。LTPⅠ型蛋白分子量大約為8～10 kDa，LTPⅡ型蛋白分子量約為7 kDa［6］。隨著在植物中鑒定的LTP蛋白增多，已有的按蛋白分子量分類的方法已經滿足不了區分不同種類LTP蛋白的需求。因此，Boutrot等［2］基于對水稻、小麥、擬南芥的全基因組分析，根據8個半胱氨酸序列的同源性將LTP蛋白分為9類（Ⅰ～Ⅸ）［2］。LTP成員具有多種生物學功能，主要涉及磷脂轉運、信號轉導、植物生殖發育、病原菌防御和非生物脅迫反應等多個生物學過程。已知在煙草中超表達小麥LTP3F1基因，轉基因植株抗真菌病害能力得到增強［7］；在山新楊中超表達ThLTP，轉基因植株在逆境脅迫下相對野生株具有更強的抗脅迫能力［8，9］。表明LTP在植物適應各種逆境脅迫中發揮著重要作用。

谷子（Setaria italicaL.）俗稱小米，又稱為粟，是起源于我國的傳統優勢作物及糧飼兼用作物，在我國、印度、日本等廣泛種植［10］。在禾本科植物中，谷子具有發達的根系、水分利用率高、蒸騰系數小、適應性強、抗旱抗鹽堿能力突出、化肥農藥用量少，是典型的抗旱節水作物及環境友好型作物。隨著全球氣候變化和我國工業化進程加快，我國水資源缺乏形勢日益嚴峻，土壤鹽漬化加重，鹽堿地面積日益擴大。提高抗旱耐鹽作物的種植比例是節約水資源、高效利用耕地的有效途徑。而谷子作為一種節水耐旱耐鹽堿作物，其在節水農業及可持續發展農業中的優勢一目了然，也必將在應對世界水資源短缺中作為重要的戰略儲備作物發揮作用。

鑒于谷子LTP基因的功能研究還較少，本研究室前期通過TMT（tandem mass tags）蛋白定量方法解析了干旱脅迫下谷子的差異蛋白組，并鑒定到一個響應干旱脅迫的脂質轉運蛋白（K3YAY4），干旱下其編碼基因表達明顯上調，進一步克隆到該基因并命名為SiLTP1（XM-004977323），并對SiLTP1進行了生物信息學分析和不同脅迫下的表達特性檢測，為深入研究谷子LTP的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養與處理

挑選籽粒飽滿的“豫谷一號”種子播種于96孔培養盒中，28℃恒溫培養箱（光照16 h、黑暗8 h）水培兩周至三葉期，分別用15%PEG6000處理，于0、2、6、12 h取幼苗葉片迅速放入液氮中-80℃保存備用；分別用200 mmol/L NaCl、50 μmol/L ABA、50μmol/L MeJA處理，于0、1、2、4、6、12、24 h取幼苗葉片迅速放入液氮中，-80℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及反轉錄 使用TransZol Plant試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）提取幼苗葉片的RNA，單鏈cDNA合成根據Prime-ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司）操作。

1.2.2 谷子SiLTP1基因的克隆 檢索NCBI數據庫獲得SiLTP1核苷酸序列，使用Primer Premier 5設計基因特異引物SiLTP1-S1：5′-ACCAGCAAAGCAAAGCAC-3′和SiLTP1-A1：5′-GTATGTAGCGACGGTGGAG-3′，由青島擎科生物工程有限公司合成。以谷子單鏈cDNA為模板進行PCR擴增。PCR體系為：TransStart FastPfuDNA Polymerase 0.5μL，5×TransStart FastPfubuffer 4μL，dNTP 2μL，SiLTP1-S1 1μL，SiLTP1-A1 1μL，單鏈cDNA 1μL，ddH2O補齊到20μL。反應程序：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，34個循環；72℃10 min。

PCR產物經電泳檢測后，使用Easy-Pure Quick Gel Extraction Kit切膠回收目的基因片段，連接至pEASY?-Blunt3載體上，并轉化到大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞中，在含Amp（ampicillin，氨芐青霉素）抗性的LB平板上過夜培養，挑取單個菌斑，進行菌液PCR。將驗證后的陽性克隆送到青島擎科生物工程有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 使用ExPASy網站（http：//www.expasy.org/#）計算SiLTP1蛋白的理論分子量、等電點等基本參數，使用在線網站SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白結構域進行預測，使用在線工具SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白信號肽序列，通過TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白進行跨膜結構域分析，利用SOPMA（https：//www.expasy.org/proteomics）預測蛋白的二級結構，運用SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線預測蛋白的三級結構，利用DNAMAN軟件對來自不同植物的LTP氨基酸序列進行同源比對分析，利用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ）構建系統進化樹。

1.2.4 qRT-PCR檢測SiLTP1在不同處理下的表達模式 根據SiLTP1基因全長序列，使用Beacon Designer 8設計熒光定量PCR引物SiLTP1-S2：5′-ATGGCTCGCGCTCAGGTGGTG-3′和SiLTP1-A2：5′-CACTTGGATGGGATGCTGGC-3′，以谷子持家基因SiActin（NCBI登錄號：XM-004978702）為內參，在ABI PRISM 7900HT（Applied Biosystems）熒光定量PCR儀上進行目的片段擴增。擴增體系為20μL，包括：稀釋10倍的cDNA模板1μL，SiLTP1-S2 1μL，SiLTP1-A2 1μL，2×Rox 10μL，ddH2O 7μL。擴增條件：95℃10 min；之后95℃15 s，60℃1 min，40個循環；95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s；60℃15 s。使用2-ΔΔCt算法計算SiLTP1基因在不同處理下的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 谷子SiLTP1基因的克隆

以谷子單鏈cDNA為模板，以SiLTP1-S1、SiLTP1-A1為引物進行PCR擴增，得到一條354 bp的條帶（圖1）。將目的條帶切膠回收后與克隆載體pEASY?-Blunt3連接，轉化大腸桿菌，通過菌液PCR驗證，且測序結果正確，證明其為目的基因，并命名為SiLTP1。

圖1 SiLTP1 cDNA的PCR克隆

2.2 SiLTP1編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 SiLTP1編碼蛋白的結構分析 使用Ex-PASy網站對SiLTP1核苷酸序列進行分析，結果顯示，該基因編碼117個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為11.5 kDa，等電點為9.24，不穩定指數33.94，推測SiLTP1蛋白屬于堿性穩定蛋白。

使用在線網站SMART對SiLTP1基因編碼蛋白結構域進行預測，結果（圖2）顯示，在第7～26個氨基酸之間含有一個跨膜螺旋區域。另外，在第28～113個氨基酸之間還有一個AAI結構域，該結構域存在于植物脂質轉運蛋白、種子貯藏蛋白及α-淀粉酶抑制劑結構域家族蛋白中。

圖2 SiLTP1蛋白結構域預測

2.2.2 SiLTP1蛋白信號肽和跨膜結構域分析

通過SignalP 4.1對SiLTP1蛋白序列進行信號肽分析，結果（圖3）顯示，第1～28個氨基酸殘基為信號肽序列，第29個和第30個氨基酸殘基之間為信號肽裂解點。通過TMHMM對SiLTP1蛋白序列進行跨膜結構域分析，結果顯示，在第7～26個氨基酸處存在一個螺旋跨膜區（圖4），N端位于膜內，C端位于膜外。

圖3 SiLTP1蛋白信號肽預測

圖4 SiLTP1蛋白跨膜結構域分析

2.2.3 谷子SiLTP1蛋白的二級及三級結構預測

采用SOPMA進行SiLTP1蛋白二級結構分析，結果（圖5）顯示其二級結構主要由α-螺旋（alpha helix，55.56%）、無規則卷曲（random coil，34.19%）、延伸鏈（extended strand，8.55%）組成。利用SWISS-MODEL對SiLTP1蛋白進行三維結構建模，結果（圖6）顯示，SiLTP1蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲組成；螺旋結構折疊形成一個中心疏水性裂隙，用于結合疏水性配體。

圖6 SiLTP1蛋白的三級結構預測

2.2.4 部分LTP蛋白的同源比對分析 利用DNAMAN對來自谷子、水稻（Oryza sativa，Os）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、臘梅（Chimonanthus praecox，Cp）、陸地棉（Gossypium hirsutum，Gh）的代表性LTP蛋白序列進行同源比對。結果顯示，SiLTP1含有典型的8個高度保守的Cys位點，其分布為28-C-38-C-53-C-54-C-74-C-76-C-99-C-113-C（其中C表示半胱氨酸，數字表示氨基酸殘基所在位置）；并且具有LTP保守的T/S-X-X-D-R/K五肽結構域（圖7），該結構域與脂質結合、轉運有關。

圖7 部分LTP蛋白的同源比對分析

2.2.5 SiLTP1的進化樹分析 利用MEGA 7.0對谷子中的SiLTP1蛋白與來自擬南芥、水稻的LTP蛋白構建進化樹，結果（圖8）顯示，SiLTP1在進化關系上與水稻的第一亞族LTP親緣關系較近，顯示SiLTP1屬于LTP家族中的TypeⅠ類。

2.3 SiLTP1基因表達模式分析

2.3.1 鹽脅迫、PEG模擬干旱脅迫下SiLTP1表達模式分析 如圖9所示，在200 mmol/L NaCl處理下，SiLTP1的表達出現先增加后降低的趨勢，且在鹽處理6 h基因表達量達到最高，其表達水平約為對照的160倍，之后其表達量隨處理時間的延長而逐漸降低，但仍顯著高于對照。經15%PEG6000模擬干旱處理后，SiLTP1表達量在處理6 h后顯著升高，表達量約是未處理的17倍，之后隨干旱處理時間的延長，基因表達量有所下降。

圖9 SiLTP1在不同脅迫處理下的表達模式分析

2.3.2 各激素處理下SiLTP1表達模式分析 如圖10所示，在不同激素處理下，SiLTP1具有不同的響應模式。經ABA處理24 h，SiLTP1表達表現為先上調后下降的趨勢，處理8 h，基因表達量達到最高，約為對照的33倍。MeJA處理4 h，SiLTP1表達量達到最大值，約為處理前的13倍，之后基因表達量逐漸降低。

圖10 SiLTP1在不同激素處理下的表達模式分析

3 討論

研究表明，植物脂質轉移蛋白是一類由多拷貝基因家族編碼的堿性小分子蛋白，能夠在體外可逆地結合并轉運脂肪酸、磷脂、糖脂等多種疏水分子［11］。植物LTP的分子量較小，通常為6.5～10.5 kDa，等電點一般在8.5～12.0，其在植物中含量豐富，約占可溶性蛋白總量的4%［12-18］。LTP具有相似的結構特征，包括N端由21～27個氨基酸殘基組成、能夠引導蛋白分泌到細胞外參與細胞外親脂性物質（如角質）沉積的信號肽，以及由8個高度保守的半胱氨酸組成的4個二硫鍵，其結構模型為Cys1-Xn-Cys2-Xh-Cys3Cys4-Xn-Cys5-Cys6-Xn-Cys7-Xn-Cys8；同時在C端有一非螺旋區用來結合并穩定脂質［19，20］。

本研究通過對克隆獲得的SiLTP1基因進行生物信息學分析發現，SiLTP1基因編碼117個氨基酸，蛋白分子量為11.5 kDa，等電點為9.24。將谷子與不同植物中的LTP蛋白構建進化樹，發現SiLTP1屬于LTP家族中的TypeⅠ類。SiLTP1具有脂質轉移蛋白家族典型的8 CM結構、堿性等電點、N端信號肽序列、跨膜結構域等，具備4個α-螺旋和無規卷曲組成的三級結構。綜上所述，SiLTP1基因編碼蛋白符合LTP蛋白的結構特征。

早期研究報道，植物脂質轉移蛋白在植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫過程中有著重要的作用，已知重金屬處理、冷脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫、激素（如ABA）以及病原物侵染都會誘導LTP基因的表達［21］。對于生物脅迫，早在1997年，Molina等［22］通過將大麥LTP2基因轉入煙草，發現可以明顯抑制煙草丁香假單胞桿菌的生長；Patkar等［23］研究表明，在玉米中過表達LTP基因能夠提高受體材料對稻瘟病、白葉枯病等的抗病性；Choi等［24］研究表明，過表達NtLTP1的轉基因煙草顯示出蚜蟲抗性。對于非生物脅迫，近年來，劉勇［25］研究發現通過在玉米中過表達ZmLTPL63可以提高植株抗氧化能力，從而提高植株對干旱和鹽脅迫的耐受性。徐揚［26］研究發現NtLTP4基因可以作為正調控因子參與植物的非生物脅迫響應。小麥TdLTP4基因在擬南芥中過表達能夠提高其抗旱和抗鹽能力［27］。超表達脂質轉運蛋白AZI能夠增強植物對鹽的耐受性，體內外實驗證明，AZI可通過與有絲分裂原活化的蛋白激酶MPK3結合發揮作用［28］。鑒于LTP家族在植物逆境脅迫信號的響應過程中的重要作用，推測同屬該家族的SiLTP1基因在谷子抗逆過程中也具有相似的生物學功能。

為了進一步明確SiLTP1在各種環境脅迫下的表達特性，通過qRT-PCR方法分析了SiLTP1基因在干旱、高鹽、ABA以及MeJA處理下的表達情況。其中，鹽處理后，基因表達量顯著升高，說明SiLTP1可響應鹽脅迫，且在鹽處理6 h時其表達量約為未處理時的160倍，響應程度較高，顯示該基因可能在谷子鹽脅迫響應過程中發揮重要作用。PEG模擬干旱處理也可誘導基因的表達，且在處理6 h時基因表達量出現明顯上調，顯示該基因可能參與了谷子的干旱脅迫響應。激素處理條件下，谷子幼苗經ABA處理后，SiLTP1基因的表達量在8 h時達到未處理時的33倍，表明SiLTP1的表達受ABA的影響，推測該基因可能參與ABA依賴信號轉導途徑。經MeJA處理后基因表達量也有明顯升高，已知MeJA是植物抗病防御過程中的重要信號分子，表明SiLTP1基因可能參與致病菌的防御過程。綜合分析該基因在各處理下響應程度的不同，推測谷子SiLTP1基因作為LTP家族成員，可能在谷子抗逆、抗病等過程中發揮作用，并主要參與鹽脅迫的響應和應答途徑及ABA調控的相關途徑。但其具體的生物學功能及作用機制還需要進一步研究。