西瓜種質M08甲基磺酸乙酯誘變條件篩選

王春霞　何亞萍　李陳浩　曾郅隆　楊建強　馬含月　魏春華　張顯

摘? ? 要：為構建西瓜突變體庫并創制優異突變新材料，以西瓜種質M08為試材，設置6個甲基磺酸乙酯（EMS）濃度（φ）（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）和3個誘變時間（12 h、18 h和24 h）的處理組合，根據相對成苗率來篩選最佳EMS誘變條件。結果表明，西瓜種質M08對EMS具有較強耐受性;M1代出苗率和成苗率均隨著EMS濃度的升高和誘變時間的延長呈下降趨勢。為了獲得較大的突變群體，同時保證一定的誘變率，最終采用開殼后溫湯浸種4 h，相對成苗率接近半致死劑量的1.5% EMS浸種12 h 或者1.0% EMS浸種24 h的處理組合，作為西瓜種質M08 EMS誘變的最佳條件，研究結果為下一步構建西瓜突變體庫和通過誘變創制西瓜新材料奠定基礎。

關鍵詞：西瓜;種子;EMS誘變;相對成苗率

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）10-026-06

Optimation of EMS mutation in watermelon germplasm M08

WANG Chunxia1， HE Yaping1， LI Chenhao1， ZENG Zhilong1， YANG Jianqiang1， MA Hanyue2， WEI Chunhua1， ZHANG Xian1

（1. College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Dongtai National Modern Agricultural Industrial Park， Dongtai 224200， Jiangsu， China）

Abstract： In order to construct watermelon mutant library and create new mutant materials， six EMS concentrations （0， 0.5%， 1.0%， 1.5%， 2.0%， and 2.5%） and three treatment times （12 h， 18 h and 24 h） were combined to screen the best EMS mutation condition according to the seedling relative growth rate. The results showed that the watermelon germplasm M08 had a strong tolerance to EMS， and the germination rate of all treatments were higher than 60%. Both the emergence and seedling rates of M1 generation were affected by EMS treatment， which showed similar downward trends corresponding to the increase of EMS concentration and the extension of mutation time. In order to obtain a large mutagenesis population and ensure a high mutation rate， the following condition was preferentially selected as the best EMS mutation condition for watermelon germplasm M08： After soaking for 4 h in warm water， the seeds without coats were treated with 1.5% EMS for 12 h or with 1.0% EMS for 24 h， of which the relative seedling rates were close to the median lethal dose. The present results? provide a theoretical reference for construction of watermelon mutagenesis libraryandcreate new materials by EMS treatment.

Key words： Watermelon; Seed; EMS mutation; Relative seedling growth rate

西瓜（Citrullus lanatus L.）為葫蘆科西瓜屬一年生草本蔓生植物，原產于非洲，經馴化后成為了可食用的西瓜。我國是西瓜生產和消費的第一大國，目前收集保存的西瓜種質資源有1500份左右[1]。自20世紀50年代以來，經過育種工作者的不斷努力，我國的西瓜品種已經實現了至少5次更新換代，極大地推動了我國西瓜產業的發展。然而，長期的人工選擇育種導致現有的西瓜遺傳基礎狹窄，使得部分優良性狀丟失（如抗性基因等），明顯影響了西瓜品種的多樣化選育進程[2]。因此，利用誘變技術創制新的育種材料，可以有效地解決這一問題，同時對拓寬遺傳背景、深度挖掘重要功能基因也具有重要作用[3-4]。

甲基磺酸乙酯（EMS）因其具有誘變突變率高、誘變效果好、成本低、易操作、突變范圍廣、不易產生染色體畸變等特點而成為應用最廣泛的化學誘變劑[5-11]。目前，已有多種作物通過EMS實現了種質創新和新品種選育，如大麥[12]、大豆[13-14]、花生[15-17]、綠豆[18]以及番茄[19-20]等。最近10年，才有關于葫蘆科作物利用EMS構建突變體庫的研究報道，甜瓜[21]是最早利用EMS創建突變體庫的，篩選出的突變體不僅能夠創制新的育種材料，還可為基因功能解析提供珍貴資源，加速其分子研究進程，如Galpaz等[22]利用EMS誘變技術成功獲得甜瓜橙黃色瓜瓤突變體，并克隆類胡蘿卜素異構酶基因yofI。種子是EMS誘變處理最常用的材料，其優點在于操作簡單、便于大量處理，而且無需設備儀器便可以在短時間內構建大量的突變群體。劉忠松等[23]通過對多種作物種子的EMS誘變條件進行探索分析，發現多數作物種子的適宜EMS誘變濃度在0.3%～1.5%之間，誘變時間以不超過24 h為宜。如在葫蘆科作物中，王學征等[24]認為1.0%濃度的EMS浸泡9 h為西瓜W1-17的最佳誘變條件，然后對M1和M2代群體進行表型觀察，成功地構建了西瓜突變體庫。康寶珊等[25]研究發現瓠瓜種子開殼后有助于提高種子對EMS的敏感性，最終采用開殼浸種4 h，1.5%濃度的EMS處理8 h為瓠瓜種子誘變的最適宜條件。弭寶彬等[26]研究了處理濃度和處理時間對冬瓜種子萌發和生長的影響，表明冬瓜種子最佳誘變條件為1.2%EMS誘變處理12 h，依此成功構建了冬瓜突變體庫。Chen等[27]認為黃瓜品系406的最佳誘變條件為1.5%的EMS，處理12 h。程蛟文等[28]首次以苦瓜干種子為材料，明確了清水浸種8 h后，用1.5% 或者1.2%的EMS溶液處理2 h是苦瓜EMS誘變的適宜條件。

本研究以西北農林科技大學園藝學院西甜瓜課題組的核心種質M08為試驗材料，該種質具有優異的農藝性狀和良好的抗逆性，如高抗枯萎病、兼抗炭疽病，以及良好的抗旱性等[29-31];現已應用于課題組多個品種的選育，如西農8號、農科大6號和農科大11號等[32-33]。EMS處理種子后可誘變產生高密度的點突變，無外源基因滲入，其優異突變材料可直接用于遺傳育種中。通過設置不同的EMS溶液濃度和不同誘變時間的處理組合，統計和分析各處理組合對種子發芽率、相對出苗率、相對成苗率的影響，同時對處理獲得的西瓜幼苗進行田間農藝性狀觀察，確定西瓜種質M08 的EMS誘變適宜條件，旨在為下一步構建西瓜突變體庫以及創制西瓜新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西瓜種質M08由西北農林科技大學園藝學院西甜瓜課題組提供，該種質果肉質地脆細、瓤色深紅，口感極佳，且具高產潛力。EMS（甲基磺酸乙酯）原液購自Sigma-Aldrich公司（貨號：M0880），為無色溶液，用0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.0）為溶劑，按照體積分數配制不同濃度的EMS溶液[24]。EMS誘變試驗于2020年5月在西北農林科技大學園藝學院蛋白分析實驗室進行，誘變材料篩選在楊凌揉谷鎮權家寨西甜瓜試驗基地進行，于2020年11月結束。

1.2 方法

設置6個EMS濃度梯度（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）和3個誘變時間（12 h、18 h、24 h），共18個處理組合，并以磷酸緩沖液為對照。每個處理50粒，重復3次。具體操作流程為：選取西瓜種質M08的飽滿種子，嗑開其種臍部位，溫湯浸種4 h，用吸水紙將種子表面水分吸干后，置于50 mL離心管內，在通風櫥中加入20 mL EMS溶液，在搖床上分別震蕩處理12 h、18 h和24 h，全程用黑色塑料袋遮光（EMS見光易分解）;處理結束后，采用硫代硫酸鈉溶液作為反應終止劑，使用1 mol·L-1硫代硫酸鈉（Na2S2O3）洗1次后，再使用100 mmol· L-1硫代硫酸鈉（Na2S2O3）洗2次，每次洗5 min;將各處理的種子做好標記后裝于紗網袋中，流水沖洗5～6 h，瀝干水分后，用濕毛巾包裹裝于塑封袋內，置于28 ℃暗培養箱內催芽。每隔24 h觀察并記錄種子發芽情況，以對照組全部發芽的當天（第3天）作為最終統計發芽率的時間。

隨后將發芽種子播于科研溫室的50孔穴盤中，待種子萌發后，統計各處理的出苗數，播種后第20 天計算各處理的相對出苗率，第40 天統計各處理的成苗情況并計算成苗率以及相對成苗率，成苗的標準是植株具有生長點及2片以上真葉。相關指標計算公式如下：

發芽率/%=（發芽總數/供試種子數）×100;

出苗率/%=（出苗總數/供試種子數）×100;

相對出苗率/%=（出苗率/對照出苗率）×100;

成苗率/%=（成苗總數/供試種子數）×100;

相對成苗率/%=（成苗率/對照成苗率）×100。

于2020年8月16日，將誘變處理獲得的全部幼苗在3葉1心時定植于楊凌區揉谷鎮權家寨西甜瓜試驗基地的日光溫室中，采用寬壟種植，膜下滴灌及吊蔓栽培的形式，種植壟寬70 cm，植株雙行定植于種植壟上，壟溝寬50 cm，溝深15 cm，株行距均為50 cm，每壟40株;定期觀察植株的田間表型，篩選變異植株。

1.3 數據分析

采用SPSS19.0軟件進行方差分析，并采用Duncan檢驗確定各處理之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同處理組合對種子發芽率的影響

由表1可知，在相同的誘變時間內，種子的發芽率隨著濃度的升高而逐漸降低。EMS浸種處理12 h，僅在濃度為2.5%時發芽率才顯著低于對照，其余處理間無顯著差異，且發芽率仍在90%以上，表明EMS浸種處理12 h對種子發芽率抑制作用弱。當EMS濃度大于1.0%、浸種時間為18 h和24 h時，抑制作用變得顯著;如浸種處理18 h時，與對照相比，濃度為1.5%、2.0%和2.5% 的發芽率分別降低了18.00%、20.00%和24.67%。

在相同的EMS濃度處理條件下，種子的發芽率隨著時間的延長而逐漸降低。濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%時，浸種處理24 h的發芽率比浸種處理12 h的發芽率分別下降了8.85%、19.17%、23.45%;濃度為2.5%、浸種處理24 h時，發芽率僅為60.00%，相比于處理12 h、18 h分別降低了35.71%、20.35%。濃度由1.0%升到1.5%，浸種處理18 h和24 h的發芽率均出現大幅降低的現象，這表明M08種質對EMS具有一定耐受性，經高濃度的EMS處理才會對其發芽率產生較為明顯的抑制作用。

綜上所述，EMS溶液濃度和誘變時間都會對西瓜種子發芽率產生影響，當濃度相同時，種子的發芽率會隨著時間的延長而降低;當浸種時間相同時，種子的發芽率會隨著濃度的升高而降低。然而，相比于已有研究文獻[24]，本試驗中采用的最高濃度和時間均遠高于他人試驗中所采用的，但是發芽率仍未降至50%以下，這表明種質M08對EMS具有較強的耐受性。

2.2 不同處理組合對相對出苗率和相對成苗率的影響

由表2可知，EMS處理對種子M08的相對出苗率和相對成苗率有較大影響，且相對出苗率與相對成苗率的變化趨勢一致，均隨著EMS濃度升高和誘變時間延長呈下降的趨勢。試驗結果表明，當濃度為0.5%時，誘變處理12、18和24 h的相對出苗率與對照差異不顯著;當EMS濃度為1.0%時，18和24 h的相對出苗率與對照差異顯著，而12 h不顯著;當濃度大于1.0%時，3個處理時間的相對出苗率與對照均有顯著差異，且相對出苗率均大于50.00%，比如濃度為2.5%時，誘變處理12、18和24 h的相對出苗率分別為75.19%、59.72%、58.25%。試驗結果表明誘變濃度和處理時間都會影響種子的相對出苗率，當濃度一定時，隨誘變時間的增加，種子的相對出苗率呈逐漸降低的趨勢;當誘變時間一定時，種子的相對出苗率也會隨著時間的延長而逐漸降低。

試驗結果表明，EMS處理對M08種子的相對成苗率影響較大，各處理組合的相對成苗率均顯著低于對照。當誘變時間為24 h時，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%濃度的EMS處理后種子的相對成苗率分別為71.31%、51.16%、40.31%、37.98%和23.25%，相比于誘變處理12 h時的相對成苗率，分別降低了20.68%、15.95%、21.65%、21.77%和37.09%;由此可以得出，EMS濃度的升高和誘變時間的延長都會導致種子的相對成苗率降低，且高濃度、長時間的處理組合還會對幼苗的生長造成嚴重的影響。

為獲得較大的突變群體和保證一定的變異率，在本研究中將相對成苗率的半致死劑量作為篩選標準[24]。其中，12 h、1.5%EMS處理組合的相對成苗率為51.45%，24 h、1.0%EMS處理組合的相對成苗率為51.16%，均接近半致死劑量。所以確定種子開殼后溫湯浸種4 h，然后采用1.5%的EMS浸種處理12 h或者1.0%的EMS浸種處理24 h為西瓜種質M08較適的誘變處理條件。

2.3 不同誘變處理組合對M1代植株農藝性狀的影響

苗期調查結果顯示（圖1），相比于對照，M1植株的長勢明顯較弱，主要表現為開花晚、植株矮小、葉片畸形等。經EMS處理過的大部分植株在生長初期出現了不同程度的真葉皺縮或葉片不伸展等現象（圖1-F），而且這些植株在生長后期均表現出矮化的癥狀，這可能是與葉片面積小、光合作用弱有關;此外，還出現了子葉連結（圖1-B）、子葉翅狀（圖1-C）、3片子葉且無生長點（圖1-D）等現象，這些幼苗在后期的生長過程中個別葉片呈現畸形或死亡，表明EMS會使植物發生生理性損傷;還出現了嵌合體葉（圖1-G），但在后期的生長發育過程中會逐漸恢復;在觀察中發現葉形變異也較多，其中如植株整株葉片變狹長、裂刻變深（圖1-H）;莖之間出現粘連、并生的現象（圖1-I）;以及葉片的著生方式由互生變為輪生，連續3個節位以上每個節位上開2～3朵花（圖1-J）;變異還會表現在花器官上，正常的雄花和雌花的花瓣數為5（圖1-K），而變異的雄花花瓣數3～9枚不等（圖1-L～O），變異的雌花花瓣數為3枚（圖1-P）。

3 討論與結論

本試驗設置6個EMS濃度和3個誘變時間共18個組合來處理M08種子，種子的發芽率隨著EMS濃度的升高和誘變時間的延長而顯著降低，表明EMS能夠抑制種子的萌發。此前，在西瓜種子[24]和冬瓜種子[26]的誘變處理試驗中，均認為EMS溶液濃度比誘變處理時間對種子的發芽率影響更大，就本試驗的發芽率指標來看，誘變處理時間與EMS溶液濃度都會對種子的發芽率產生較大的影響，浸種處理12 h時，0～2.5%濃度的發芽率仍可達90%以上，說明EMS濃度對種子發芽率有影響，但抑制作用較弱;而當浸種時間延長至24 h時，濃度大于1.0%時，抑制作用逐漸顯著，當溶液濃度為2.5%時，發芽率僅有60.00%，說明隨著濃度的增加，浸種時間對種子發芽率的抑制作用越明顯[34]。西瓜種質M08對EMS有較強的耐受性，只有EMS的溶液濃度增加到1.5%以上時，才對各生理指標的抑制效果變得顯著，發芽率、相對出苗率和相對成苗率均呈現出一致的變化趨勢，都是隨著EMS濃度的升高和誘變時間的延長呈下降的趨勢，這與溫日宇等[35]、吳思遠等[36]的研究結果一致。利用EMS誘變技術構建突變體庫，是創制新種質、選育新品種的重要手段，因此確定適宜的誘變條件尤為關鍵。通常認為，誘變處理的原則是既能產生較多的變異，同時又不致嚴重地損傷材料。為了獲得一定量的突變群體，通常把誘變處理后50%植株存活的劑量即半致死劑量作為選擇依據[37]。對于植株存活的定義，前人均有不同見解，葉衛君等[18]、康寶珊等[25]和程蛟文等[28]將發芽率或相對發芽率作為半致死劑量，但這可能會使得最終獲得的突變群體較小。而Vicente-Dólera等[38]為了收獲到較多的可育株，將花粉活力作為半致死劑量來確定最佳的誘變劑量，但此標準會遺漏一些突變體。因此，筆者在本研究中綜合考慮了后代的變異率和成活率，將幼苗具有生長點及2片以上真葉作為植株成苗的依據，以相對成苗率的半致死劑量來確定誘變的最佳條件。

綜上，通過研究不同EMS濃度和誘變時間組合處理對西瓜種子發芽率、相對出苗率和相對成苗率的影響以及對植株表型的觀察，確定了開殼后先溫湯浸種4 h，然后用1.5%的EMS浸泡12 h或1.0% EMS浸泡24 h的處理組合為西瓜種質M08誘變處理的最適條件。研究結果為下一步利用EMS誘變技術開展西瓜誘變育種相關研究提供了重要參考。

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