煙草彎孢菌葉斑病病原菌鑒定及生物學特性研究

何世芳，桑維鈞，曹毅，孫光軍，潘忠梅，陸寧，陳興江

摘? 要：為明確貴州煙草彎孢菌葉斑病病原菌種類及生物學特性，分別采用組織分離法和離體葉片接種法對其病原菌進行分離和致病性測定，使用形態特征結合分子生物學方法對病原菌進行分類鑒定，并對其生物學特性進行研究。結果表明，該病原菌在以ITS序列構建的發育樹中與棒狀彎孢（Curvularia clavata）聚為一支，且支持率為100%，結合形態特征將其鑒定為棒狀彎孢。生物學特性研究表明，病原菌菌絲生長最適溫度為28 ℃，最適pH為8，在燕麥瓊脂（OA）培養基上生長最快，以可溶性淀粉為碳源、牛肉浸粉為氮源時對菌絲生長最有利;菌絲致死溫度為53 ℃，10 min，光照對菌絲生長無顯著影響。研究結果可為煙草彎孢菌葉斑病防治提供理論依據。

關鍵詞：煙草;葉斑病;棒狀彎孢;病原菌鑒定;生物學特性

Identification and Biological Characterization of Curvularia clavata Causing the Tobacco Leaf Spot Disease

HE Shifang1，2， SANG Weijun1*， CAO Yi2*， SUN Guangjun3， PAN Zhongmei1，2， LU Ning2， CHEN Xingjiang2

（1. College of Tobacco， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang 550081， China; 3. Tobacco Department Guizhou Branch of China Tobacco Corporation， Guiyang 550025， China）

Abstract： To clarify the pathogen causing leaf spots of tobacco in Guizhou Province and its biological characteristics， the pathogen was obtained by using the method of tissue isolation. Its pathogenicity was tested in vitro with inoculated leaves， and the pathogen was classified and identified with morphological characteristics combined with molecular biological methods. The biological characteristics of the pathogen were also studied. The results showed that the pathogen clustered with Curvularia clavata in the phylogenetic tree based on ITS sequence， and the support rate was 100%. Combined with the morphological characteristics， the pathogen was identified as Curvularia clavata. The study of biological characteristics showed that the optimum temperature for mycelium growth was 28 ℃， the optimum pH was 8， the fastest growth was on oat agar （OA）， and it was most favorable for mycelium growth when soluble starch was used as carbon source and beef powder as nitrogen source， and the lethal temperature of mycelium was 53 ℃ and 10 min. The light had no significant effect on mycelial growth of Curvularia clavata. The results can provide a theoretical basis for the control of tobacco Curvularia leaf spot.

Keywords： tobacco; leaf spot disease; Curvularia clavata; pathogen identification; biological characteristics

煙草是我國重要的經濟作物[1]。近年來，由于煙草種植制度改變、氣候條件變化、種植品種單一和煙田連作比例較高等原因，導致烤煙病害呈明顯上升趨勢。貴州是我國第二大煙區，常年種植面積達12余萬公頃，在烤煙生長中后期葉斑類病害在部分煙區發生偏重，嚴重影響煙葉生產[2]，病害防治形勢日益嚴峻。

彎孢屬真菌是一類重要的植物病原菌，其種類繁多[3-4]，可危害玉米、燕麥、水稻、甘蔗和小麥等多種禾本科植物 [5-10]，引起葉斑、種子變色和苗枯等癥狀[11]。20世紀60年代印度北部首次報道了煙草彎孢葉斑病，我國于90年代首次在廣西壯族自治區發現由Curvularia verruculose Tandou et Bilgrami引起的煙草彎孢菌葉斑病[12]，1997年陳瑞泰等[13]在廣西發現煙草彎孢菌葉斑病，鑒定其病原菌為Curvularia trifolii Boed，為偶發病害;2016年CHEN等[14]在貴州遵義植煙區發現了由Curvularia trifolii引起的煙草葉斑病，重發地塊發病率高達30%。

2020年本課題組在對貴州主產煙區煙草葉斑類病害調查時發現類似癥狀病葉，通過鏡檢初步判斷病原菌為彎孢菌，現有研究關于該病害的報道主要集中在癥狀描述和病原菌鑒定[12-14]，目前尚無生物學特性研究的報道。為掌握該病害病原菌種類及發生特征，本研究對病原菌進行分離及致病性測定，采用形態學及分子生物學方法進行病原菌鑒定，進一步對其生物學特性進行研究，以期為煙草彎孢菌葉斑病防治提供理論支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

病害樣本：采集自貴州省遵義市煙區，烤煙K326具有褐色壞死病斑、外圍具有明顯黃色暈圈的病葉。

致病性測試品種為K326，按常規方法育苗，盆栽管理至15葉期進行測試。本研究供試培養基見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌分離純化及形態學鑒定? 采用組織分離法對病害標本進行分離[15]，獲得的純化菌株接種至PDA培養基，25 ℃培養7 d后進行形態學鑒定[16]。

1.2.2? 病原菌致病性測定? 選取盆栽管理的健康K326葉片，采用離體葉片刺傷和無傷接種法進行致病性測試，并通過科赫式法則驗證病原菌[17]，選取其中一株致病性較強的菌株進行后續試驗（菌株編號：YC1106）。

1.2.3? 病原菌分子生物學鑒定? 采用試劑盒 DNeasy UltraClean Microbial Kit，（Qiagen）并參照說明書方法提取病原菌DNA，使用引物（上海捷瑞生物工程有限公司）ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′）/ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTA ACA GG-3′）擴增菌株的ITS基因，反應體系和擴增條件參照趙洪海等[18]的方法進行。PCR產物送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序，序列通過NBCI數據庫進行Blast分析，提交至GenBank獲取登錄號，依據比對結果下載相關模式菌株核酸序列[19]（表2），使用MAFF（http：//mafft.cbrc.jp/ alignment/server/）和TrimAI （V.1.3）分別進行序列比對和剪切[20]，使用MEGA X軟件的鄰接法（Neighbor-joining，Bootstrap value=1000）構建系統發育樹。

1.3? 病原菌生物學特性測定

1.3.1? 培養基類型對菌株YC1106生長的影響? 使用滅菌打孔器（直徑6 mm）在菌落邊緣打取菌餅，接種至12種不同培養基上[21]（表1），每個培養基3個重復，于25 ℃生化培養箱中培養。培養5 d后觀察菌落生長情況，使用十字交叉法測量菌落直徑。下同。

1.3.2? 碳、氮源對菌株YC1106生長的影響? 參照高晉等[22]的方法，以Czapek Dox Agar為基礎培養基，用等量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、山梨糖醇和可溶性淀粉代替蔗糖;同理，用等量的蛋白胨、硝酸鈉、牛肉粉、氯化銨，尿素，甘氨酸、丙氨酸和酵母粉代替硝酸鈉，制備不同碳氮源平板。在含有不同碳氮源平板中央接種菌餅，并于25 ℃恒溫下培養。

1.3.3? 溫度對菌株YC1106生長的影響? 將直徑為6 mm菌餅接種于PDA平板上，分別置于5、10、

15、20、25、28、30、35 ℃恒溫培養箱中培養。

1.3.4? pH對菌株YC1106生長的影響? 以PDA為基礎培養基，使用HCl和NaOH溶液將培養基pH調節為8個不同梯度（4、5、6、7、8、9、10和11），將菌株接至平板中央，于25 ℃恒溫培養。

1.3.5? 光照對菌株YC1106生長的影響? 將菌株接種于平板中心，在連續黑暗、連續光照和光暗交替3種條件下25 ℃恒溫培養。

1.3.6? 菌絲體致死溫度的測定? 參照王靜等[23]的方法，設置45 ℃為基礎溫度，5 ℃為一個梯度，65 ℃為最大溫度進行測定。

1.4? 數據分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0進行數據分析。

2? 結? 果

2.1? 癥狀描述

病害發生于烤煙成熟期（圖1），主要危害葉片，發病初期為淡黃色圓形斑點，后發展為圓形至橢圓形褐色病斑，邊緣伴有明顯黃色暈圈;病害發生嚴重時病斑逐漸擴大或聯合后呈近圓形或不規則形。

2.2? 病原菌致病性測定

菌株接種5 d后葉片開始出現病斑，病斑呈深褐色，外緣伴有明顯黃色暈圈;癥狀與原病害樣本癥狀相同，于發病處重新分離到原接種的菌株，證明為致病菌。煙葉在無傷及刺傷接種條件下均能發病，表明其致病性較強。

2.3? 病原菌培養性狀及形態特征

菌株于PDA培養基25 ℃培養5 d后，菌落直徑24.67 mm，菌落顏色淺棕色、不規則，氣生菌絲不發達，絨絮狀，邊緣灰白色（圖2A），培養基背面有色素產生（圖2B）。分生孢子梗圓柱狀（圖2C），棕色或深棕色，有分隔，直立或略彎，頂部屈膝狀彎曲;分子孢子多為頂側生，棒狀，大小為21.3～

33.5 μm×9.0～15.0 μm，中部顏色略深，兩邊顏色逐漸變淺，具2～3個橫隔膜，中間1～2個細胞膨大（圖2D）。依據形態特征，將病原菌初步鑒定為棒狀彎孢。

2.4? 病原菌分子生物學鑒定

應用引物ITS4/ITS5進行PCR擴增后，獲得大小584 bp的基因片段（GenBank No. MW543062），經Blast比對，菌株YC1106與棒狀彎孢Curvularia clavata同源性高達100%，進一步通過系統發育分析，該菌與Curvularia clavata（NCBI登錄號： MN623415）的遺傳距離最近，聚于同一分支（圖3），且支持率為100%，結合形態特征及分子生物學鑒定結果將煙草彎孢菌葉斑病致病菌鑒定為棒狀彎孢菌。

2.5? 病原菌生物學特性

2.5.1? 培養基類型對菌株YC1106生長的影響? 從圖4可以看出，病原菌YC1106可在12種不同的培養基上生長，菌落狀態以OA培養基上的狀態最佳，菌落直徑也最大，菌落直徑雖在高氏1號合成瓊脂、TA和CA上與OA間差異不顯著，但菌株在這3種培養基上氣生菌絲更稀疏，由此判斷OA為最佳培養基。病原菌在WA上的生長狀態最差，菌絲尤為稀疏，不適宜病原菌生長。

2.5.2? 碳氮源對菌株YC1106生長的影響? 如圖5-6所示，菌株YC1106在所供試的8種碳、源中均能生長，在供試碳源中，病原菌對可溶性淀粉的利用效果最佳，培養5 d菌落直徑為52.33 mm;而對葡萄糖的利用效果最差，菌落直徑為16.5 mm。在氮源利用中，最適氮源為牛肉浸粉，菌落直徑為52.33 mm;尿素作為氮源時菌落直徑最小且菌絲尤為稀疏，不利于病原菌生長。

2.5.3? 溫度對菌株YC1106生長的影響? 如圖7所示，病原菌生長溫度較廣，在10～35 ℃范圍內均可生長，在5 ℃時幾乎不生長，在28 ℃菌落直徑達到最大，培養5 d平均菌落直徑為47.17 mm;在10～28 ℃范圍內，菌落生長直徑隨著溫度的升高而增大，并且氣生菌絲更發達，培養基背面顏色更深。

2.5.4? pH對菌株YC1106生長的影響? 圖8顯示，病原菌對酸堿環境的適應范圍較寬，在pH 4～11內均能生長，當pH為8時最適宜菌絲生長，培養5 d菌落直徑為50.83 mm。

2.5.5? 光照對菌株YC1106生長的影響? 如圖9所示，光照處理對病原菌的生長無顯著影響，連續光照時菌絲生長平均菌落直徑最大，培養5 d后菌落直徑為39 mm。

2.5.6? 致死溫度的測定? 在以45 ℃為基礎溫度，5 ℃為梯度進行測定，55 ℃水浴10 min后，培養基上未見菌落;再以51 ℃為基礎溫度、1 ℃為梯度，53 ℃水浴10 min后培養基上未見菌絲生長，因此，推斷菌株YC1106菌絲的致死溫度為53 ℃水浴10 min。

3? 討? 論

棒狀彎孢菌隸屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、彎孢屬（Curvularia）[16]，據報道，該菌寄主范圍較廣，可侵染溫郁金、麻風樹、菠蘿、和玉米等[24-26]多種作物，除引起植物病害外，該屬真菌還可引起皮膚暗色絲孢霉病[27]。近年來，由該屬真菌侵染植物引發的病害不斷被報道[28-30]，在農業生產上應引起重視。本文通過形態學結合分子生物學方法，將病原菌鑒定為棒狀彎孢（Curvularia clavata），采集到的病葉癥狀與已有報道類似[12-14]，但其形態特征及分子生物學鑒定結果不同，說明該屬真菌可能有多個種能侵染煙草發病。

病原菌的生物學特性是病害早期診斷、預測與防治的基礎，對進一步探明病害發生規律具有重要意義。本文研究結果表明，Curvularia clavata 菌絲在10～35 ℃范圍內均能生長，最適生長溫度為28 ℃，致死溫度為53 ℃，研究結果與陳旭玉等[31]報道的最適溫度基本相符。病原菌生長隨著溫度升高，培養基內顏色更深，高溫有利于其色素產生，這與劉飛等[32]的研究結果一致。貴州遵義具有夏季高溫多雨的氣候條件，適宜該病菌的生長，在生產上應加強水肥管理和田間管理抑制棒狀彎孢菌的發生，防止該病害的蔓延。病原菌對酸堿環境適應范圍較廣，在pH 4～11內均能生長，在pH=8時最適宜菌絲生長，表明弱堿性條件有利于菌絲生長。該菌能利用多種碳源和氮源，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為牛肉浸粉，以尿素作為氮源時，抑制菌絲的生長，研究結果與引起其他植物病害的同種病原最適氮源為牛肉浸粉相一致[31]，而與最佳碳源為葡萄糖存在差異[33]，導致差異的原因可能與寄主、地理來源和生態適應性有關。

鑒于棒狀彎孢菌亦可侵染玉米，本研究對合理指導玉米與烤煙輪作、間作具有重要意義。目前煙草彎孢菌葉斑病研究不夠深入，今后應對該病害抗性種質資源、發生流行規律、防治藥劑等做進一步研究，為該病害綠色防控技術和方法提供理論和技術支撐。

4? 結? 論

本研究通過形態學和分子生物學方法，將分離獲得的煙草彎孢菌葉斑病病原菌鑒定為棒狀彎孢（Curvularia clavata）。研究結果表明，該病原菌致死溫度為53 ℃，該病害是一種高溫型病害，與田間病情調查結果吻合;弱堿性條件有利于菌絲生長，能利用多種氮源和碳源，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為牛肉浸粉，光照對菌絲生長影響不顯著。該菌致病力較強，無傷口亦可侵染。

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