茯苓-山藥復配米稀和猴頭菇餅干對功能性消化不良大鼠的改善作用

鐘亞東，潘 猛，徐德昌，孫永敢，胡婕倫，聶少平，鐘虹光，堯梅香，謝明勇,

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中加食品科學技術聯合實驗室（南昌），江西南昌 330047；2.江中食療科技有限公司，江西九江 330000）

功能性消化不良（functional dyspepsia, FD）是一種常見的功能性胃腸道疾病，在全球的發病率為11%～29.2%[1]。FD由胃和十二指腸功能紊亂而引起，無器質性病變，主要癥狀為餐后飽脹、早飽感、上腹疼痛等[2]。據報道，飲食不規律、喜甜食和碳酸飲料等異常飲食行為可誘發FD[3]。雖然該病癥鮮少出現嚴重病情或危及生命，但極大地降低患者生活質量[4]。目前FD常見治療方法包括飲食調整、藥物治療以及心理干預，但療效有限且可能具有副作用[5]。因此，尋找包括傳統草藥和天然活性物質在內的藥物補充劑和替代品具有積極的現實意義[6-7]。

猴頭菇是是一種大型真菌，被認為具有保肝、健脾、養胃和助消化等功效。研究發現猴頭菇制品可顯著改善早飽、噯氣、腹脹等癥狀，促進胃排空，改善動力障礙型FD[8-9]。茯苓和山藥具有補脾養胃、健脾和胃的功效，常用于緩解胃腸道癥狀[10]。其中，多糖等活性物質被認為是其主要功效成分[11-14]。

目前，針對猴頭菇、山藥和茯苓對功能性消化不良癥狀的研究鮮見報道，且食物基質可與活性物質相互作用并影響其功效[15-17]。因此，本研究采用肝郁脾虛性功能性消化不良大鼠模型，結合劑量水平和食物基質效應，探討基于茯苓-山藥復配提取物和猴頭菇提取物開發的沖泡型米稀和酥性餅干對功能性消化不良癥狀的改善作用，以期為食藥兩用資源的開發及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓-山藥復配提取物、茯苓-山藥復配米稀、猴頭菇提取物和猴頭菇餅干 本實驗室自制；番瀉葉

華柯生態農業開發有限公司；SPF級Spargue-Dawley雄性大鼠 （112只，體質量180±20 g）、動物飼料墊料 購自湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司（許可證號：SCXK（湘）2016-0002）；鼠血清胃動素（motilin, MTL）、胃泌素（gastrin, GAS）、膽囊收縮素（cholecystokinin, CCK）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑 均為國產分析純。

超純水儀 美國Millipore公司；AL104型電子分析天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；YP10002馬頭牌電子天平 上海光正醫療器械有限公司；TGL-5-A高速離心機 上海安亭分析儀器有限責任公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標儀 美國Thermo公司；正置光學顯微鏡 日本Nikon公司；6890N型氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備方法 餅干制備：將6.25%（w/w）的水提猴頭菇提取液與低筋小麥粉、玉米淀粉、起酥油、全脂乳粉等混合攪拌，制作面團，隨之進行成型、脫模操作。采用變溫烘烤方式處理餅干生坯6～8 min。烘烤溫度依次為200～240、220～260、180～200、140～180 ℃。

米稀制備：將8.6%（w/w）的水提茯苓-山藥復配提取物與粳米粉、燕麥粉、白砂糖、水混合，攪拌均勻，過膠體磨，滾筒干燥后過篩。

番瀉葉水煎劑制備[18]：將番瀉葉浸泡于沸水中，比例為5:100 g/mL。

營養性半固體糊制備[19]：5 g羧甲基纖維素鈉溶于100 mL蒸餾水，并依次加入淀粉4 g、奶粉8 g、白砂糖4 g、活性炭4 g，攪拌均勻，配成約150 mL的黑色半固體糊。

1.2.2 模型的建立 動物適應性飼養7 d，隨機抽取8只大鼠作為正常組，其余進行造模。采用適度夾尾刺激、不規則喂養、苦寒瀉下的復合因素聯合造模法建立肝郁脾虛型FD大鼠模型[20]。方法如下：

大鼠夾尾刺激2次/d，每次30 min，即用長拆線剪鉗夾大鼠尾巴末端約1/3處（若有破損，碘伏消毒傷口），使其怒叫掙脫，并與其他大鼠打斗廝咬；采用單日喂食、雙日禁食的不規則喂養方式，且禁食日按2 mL/100 g體重灌胃大鼠番瀉葉水煎劑（苦寒瀉下），2次/d；飲水正常。14 d后，造模結束，大鼠進食恢復正常。依《中醫實驗動物模型方法學》[20]，肝郁脾虛型FD模型有以下癥狀：情緒激動，易怒；瞇眼（眼球僅暴露一半以上）；食欲不振，食量減少；體重增加緩慢，甚至下降；毛色暗黃，毛發粗亂；糞便時干時稀，拉尾排便反應陽性；精神萎靡，乏力倦怠；胃黏膜未發生器質性病變。

取造模成功大鼠分為模型組（M；生理鹽水1 mL/100 g）、陽性組（P；多潘立酮混懸液，2.7 mg/kg）、茯苓-山藥復配提取物組低、中、高劑量組（FL、FM、FH；116.1、232.2和464.4 mg/kg）、茯苓-山藥復配米稀低、中、高劑量組（FPL、FPM、FPH；675、1350和2700 mg/kg）、猴頭菇提取物低、中、高劑量組（HL、HM、HH；135、270和540 mg/kg）、猴頭菇餅干低、中、高劑量組（HPL、HPM、HPH；2160、4320和8640 mg/kg），共14組，每組8只，正常組灌胃生理鹽水（N；1 mL/100 g），持續灌胃14 d。各組大鼠末次給藥后，禁食不禁水24 h，次日上午各組大鼠均注入5%半固體糊，按10 mL/kg灌胃。30 min后處死，取相關臟器和血清，并于-80℃保存。

灌胃中劑量依照根據藥典所確定的人的推薦量（茯苓-山藥復配提取物2.58 g/70 kg/d，猴頭菇提取物3 g/70 kg/d，米稀30 g/70 kg/d，猴頭菇餅干48 g/70 kg/d），與大鼠進行等效劑量換算，換算系數為0.018。

1.2.3 大鼠行為觀察 每天觀測大鼠行為表現，記錄懶動、倦怠、瞇眼、扎堆，體形逐漸消瘦，排便次數增多等現象，判定是否造模成功。

1.2.4 大鼠體重與食量變化 適應期開始至實驗結束期間，每天記錄大鼠體重和采食量。

1.2.5 胃組織病理觀察 剪取胃部約10 mm×2 mm的組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色病理觀察。

1.2.6 胃排空率和小腸推進率的測定 胃排空率測定：取胃結扎幽門賁門，并稱量胃總質量（即胃內容物+胃組織重量），沿胃大彎剪開，洗去胃內容物后吸干稱量胃凈質量（即胃組織重量），胃排空率計算如公式（1）所示：

小腸推進率測定：取上端自幽門、下端至回盲部的整段小腸，輕輕剝離后不加牽引直鋪于白紙上，測量幽門至黑色半固體糊前沿的距離和小腸的總長度。按照公式（2）計算小腸推進率：

1.2.7 血清胃腸激素的測定 眼球取血后靜置1 h，3500 r/min離心20 min（4 ℃），取上清并依照試劑盒說明書測定中MTL、GAS和CCK含量。

1.2.8 結腸短鏈脂肪酸的測定 參照文獻[21]的方法，精確稱取結腸內容物并加入磷酸鹽緩沖液勻漿，在4 ℃下以14000 r/min離心20 min后取上清，過0.22 μm水系濾膜。取400 μL上清，乙醚提取后進行氣相分離測定。色譜柱起始溫度100 ℃，7.5 ℃/min升溫至140 ℃，再以15 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min。進樣口和火焰離子化檢測器的溫度分別240和300 ℃。氮氣流量12.5 mL/min，分流比為1:10。氫氣和空氣的流速分別為30和400 mL/min，進樣量1 μL。

1.3 統計學分析

數據采用平均值±標準差（mean±SD）表示。組間差異采用單因素ANOVA進行分析；主效應分析采用雙因素ANOVA方法，若無交互作用，即可分別對劑量和受試物種類進行主效應分析。使用Dunnetts和Tukey方法分別對單因素和雙因素ANOVA進行事后比較（Graphpad Prism 8）。交互作用，P＜0.1表示差異顯著；其他情況，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 采食量

如圖1所示，適應期間，所有組采食量無區別；造模后，與正常組相比，模型組采食量顯著下降（P＜0.05）；受試物或藥物干預后，大鼠采食量相比于模型組顯著（P＜0.05）升高，但仍顯著低于正常組（P＜0.05）。

受試物種類效應和劑量效應如表1和表2所示。干預期間，受試物種類對采食量無影響，即食物基質的存在與否以及功能活性物質的種類均不影響大鼠在干預期的采食量。與之相反，灌胃劑量水平顯著影響采食量，且高劑量組顯著（P＜0.05）高于低劑量組。

2.2 體重

如圖1所示，造模前，所有動物體重無差別；造模后大鼠體重與正常組相比顯著下降（P＜0.05）；飲食或藥物干預后，大鼠體重顯著回升（P＜0.05）。其中陽性組、FM組、FH組體重恢復至正常水平（P＞0.05）。

圖1 四種受試物對大鼠采食量和體重的影響（n=8）Fig.1 Effect of four test materials on feed intake and body weight in rats（n=8）

干預期間，不同受試物種類對采食量差異不大（表1茯苓-山藥復配提取物組體重顯著高于猴頭菇餅干組（P＜0.05），灌胃劑量對體重無顯著影響（P＞0.05）（表2）。

表1 受試物種類對功能性消化不良大鼠測試指標的影響的雙因素方差分析（n=24）Table 1 Two-way ANOVA analysis for effect of the type of test materials on test parameters in rats with functional dyspepsia (n=24)

表2 灌胃劑量對功能性消化不良大鼠測試指標影響的雙因素方差分析（n=32）Table 2 Two-way ANOVA analysis for effect of dosage on test parameters in rats with functional dyspepsia (n=32)

2.3 胃排空率與小腸推進率

如圖2所示，與正常組大鼠（70.3%±5.8%）相比，模型組大鼠胃排空率顯著降低（41.9%±6.4%；P＜0.05）。與模型組相比，各干預組（56.4%±8.0%～66.1%±6.8%）的胃排空速率顯著升高（P＜0.05），且茯苓-山藥復配各組、HPH組以及陽性組均恢復至正常組水平（P＞0.05）。小腸推進率的變化與胃排空率情況相似。結果表明四種受試物作用與陽性藥物多潘立酮效果一致，可有效改善胃腸動力。

圖2 四種受試物對功能性消化不良大鼠胃排空率（A）和小腸推進率（B）的影響（n=8）Fig.2 Effect of four test materials on gastric emptying rate (A)and small intestine propulsion rate (B) of rats with functional dyspepsia (n=8)

如表1和表2所示，受試物種類及灌胃劑量對胃排空率無顯著性影響（P＞0.05），但前者明顯影響小腸推進率：茯苓-山藥復配提取物組（58.1%±6.8%）顯著（P＜0.05）高于各猴頭菇組（52.4%±5.5%～53.2%±6.2%），而茯苓-山藥復配米稀組（57.5%±5.8%）顯著（P＜0.05）高于猴頭菇提取物組（52.4%±6.2%）。表明食物基質無作用，而不同活性物質之間差異顯著。

2.4 胃組織病理學

如圖3所示，所有組大鼠胃組織結構完整，腺體排列整齊，未見胃黏膜上皮細胞脫落、水腫及充血現象，未見胃器官實質性損傷。

圖3 四種受試物對功能性消化不良大鼠胃組織病理學觀察（40×）Fig.3 Effect of four test materials on morphological changes in gastric tissue of rats with functional dyspepsia（40×）

2.5 血清胃腸激素

如圖4所示，與正常組大鼠相比（MTL：193.6 ng/L；GAS：38.2±5.6 ng/L），模型組大鼠血清MTL（126.6±13.6 ng/L）和GAS水平（21.4±4.0 ng/L）顯著（P＜0.05）降低。與模型組相比，各干預組血清MTL（153.4±13.6～182.5±14.9 ng/L）和GAS（28.5±3.6～35.0±3.9 ng/L）水平均顯著增加（P＜0.05），其中兩者在陽性組和FM組，以及GAS在FPM組的水平均恢復至正常（P＞0.05）。

圖4 四種受試物對功能性消化不良大鼠血清胃動素（A）、胃泌素（B）和膽囊收縮素（C）水平的影響（n=8）Fig.4 Effects of four test materials on the serum levels of motilin (A), gastrin (B) and cholecystokinin (C) in rats with functional dyspepsia (n=8)

相比于正常組（267.6±14.4 ng/L），模型組血清CCK水平（357.6±20.7 ng/L）顯著（P＜0.05）增加。相比于模型組，除HL組（338.2±19.1 ng/L）外，其他組血清CCK水平（288.2±16.2～327.9±15.1 ng/L）均顯著（P＜0.05）降低。

如表1和表2所示，受試物種類顯著（P＜0.05）影響血清MTL水平，其中茯苓-山藥復配提取物組（167.6±17.0 ng/L）顯著高于猴頭菇餅干組（156.0±15.5 ng/L），而劑量無影響。受試物種類與劑量對血清GAS水平無影響，但均顯著（P＜0.05）影響血清CCK水平：茯苓-山藥復配提取物組血清CCK水平（310.6±17.3 ng/L）顯著低于各猴頭菇組（324.1±15.0～329.1±17.7 ng/L），而米稀組（314.0±17.0 ng/L）顯著低于猴頭菇提取物組（329.1±17.7 ng/L）；低劑量組（326.1±17.9 ng/L）顯著高于中劑量組（315.1±18.2 ng/L）。結果表明通過選擇受試物的種類和灌胃劑量，可優化受試物對血清胃腸激素水平的調節作用，且食物基質不干擾提取物質的相關調節作用。

2.6 結腸短鏈脂肪酸水平

如表3所示，模型組結腸總短鏈脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFAs）水平顯著（P＜0.05）低于正常組，這與其6種組成SCFA的情況一致。與模型組相比，除戊酸與異戊酸外，陽性組各SCFAs及總SCFAs水平均顯著（P＜0.05）提高；茯苓-山藥復配各組結腸乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和總SCFAs水平顯著（P＜0.05）升高；猴頭菇提取物及餅干組的結果較復雜，中劑量組的結果與茯苓-山藥復配各組相似，而低劑量組乙酸和丙酸含量顯著（P＜0.05）提高，高劑量僅增加乙酸和丁酸（限餅干組）水平（P＜0.05）。此外，結腸異戊酸和戊酸水平僅分別在FM組和陽性組檢測到顯著升高（P＜0.05）。干預后，茯苓-山藥復配各組的丙酸（除提取物低劑量組）、丁酸水平，FM組的異丁酸與總SCFAs水平，以及HM組的丙酸、丁酸恢復到正常水平。

如表1和表2所示，受試物種類及灌胃劑量作為主效應均顯著影響乙酸、丁酸和總SCFA水平（P＜0.05），而異戊酸只受受試物種類因素影響（P＜0.05）：茯苓-山藥復配組的丁酸、異戊酸和總SCFAs水平，以及其提取物組的乙酸水平均顯著高于猴頭菇組（P＜0.05）；中劑量組的乙酸、丁酸和總SCFAs水平均顯著高于低、高劑量組（P＜0.05）。丙酸、異丁酸、戊酸存在主效應交互作用（P＜0.1），未進行分析。結果表明通過選擇活性物質種類和劑量和優受試物對結腸乙酸、丁酸、異戊酸或總短鏈脂肪酸水平的調節作用，而食物基質對此無影響。

3 討論與結論

胃腸消化動力不足是FD的重要發病機理，針對FD患者的治療目標之一即為改善胃腸動力。本研究給與FD大鼠茯苓-山藥或猴頭菇相關提取物和產品均能改善胃排空率和小腸推進率，同時血清胃腸道激素（MTL、GAS和CCK）水平相應發送變化。MTL和GAS可通過刺激胃收縮，加速胃排空和/或改善小腸蠕動，而CCK作用相反。多糖是茯苓、山藥和猴頭菇的主要功能活性物質[21-23]，通常由水提法獲取。研究發現某些多糖如黃芪多糖和香菇多糖可顯著促進胃腸蠕動，并改變胃腸激素[24,25]，推測多糖是本研究中FD大鼠癥狀改善的主要功能性物質。

本研究灌胃FD大鼠各受試物后，各劑量均能不同程度地增加結腸SCFAs的水平。多糖是腸道菌群生成SCFAs的主要底物，而后者可調節宿主各項生理代謝活動，包括能量代、腸道蠕動、腸道屏障功能、腸道免疫等方面，因而多糖被視為潛在的益生元[26]。一項系統回顧與薈萃分析發現益生元在治療FD中具有一定作用[27]，這進一步表明益生元型多糖可用于治療FD。此外，Reilly等[28]報道大鼠結腸中灌輸SCFAs促進了腸道GAS的分泌，結合本研究關于血清胃腸激素的結果，推測多糖是通過促進SCFAs的生成進而改變胃腸激素的分泌，進而改善FD癥狀。同時，本研究還發現，受試物組大鼠的體重均能恢復到正常水平，但采食量仍低于正常組，這表明其他因素可能參與其中，如腸道SCFAs水平升高，影響大鼠能量代謝，進而調節體重[29]。

本研究通過比較提取物與相應產品對FD的改善作用，未發現米稀和餅干的基質影響茯苓-山藥復配提取物和猴頭菇提取物發揮功能活性。某些常用食物成分，如NaCl等鹽類可降低多糖的黏度[30]，從而影響其構象及相應的功能活性相關，如免疫活性，但可能對改善FD無作用。

綜上所述，茯苓-山藥復配米稀及猴頭菇餅干可有效緩解FD引起的食量下降和體重減輕等癥狀，改善胃腸動力。推測其作用與SCFAs的生成及胃腸動力相關血清胃腸激素的變化相關。此外米稀及餅干的作用與原功能性提取物無差異。