白芍總苷對高尿酸血癥腎損害大鼠腎臟的保護作用

劉冬戀，秦 琴 ，楊 婷，何欣宇，張雨晴，王玉江

（1.成都醫學院四川養老與老年健康協同創新中心，四川成都 610500；2.成都醫學院藥學院，四川成都 610500）

目前，國內外高尿酸血癥的患病率和發生率都在逐年增高，僅中國患者已達1.2億[1]。對我國5376名老年居民抽樣調查發現，我國老年人高尿酸血癥患病率為13.1%，尿酸水平和高尿酸血癥患病率均隨年齡增長而升高[2]。高尿酸血癥是指體內嘌呤代謝紊亂，尿酸生成過多或排出過少，引起血尿酸升高，超出血漿正常濃度。高尿酸血癥不僅在高血壓、心房顫動、心力衰竭、冠心病和心血管死亡等心血管疾病的發生中發揮作用，而且也是腎臟疾病發生和發展的獨立危險因素[3-4]。目前治療高尿酸血癥的西藥普遍存在不良反應，例如別嘌醇會引起嚴重的超敏反應，腎功能不全者患者只能由小劑量開始治療，在治療期間還應密切觀察相關不良反應發生情況，及時給予干預。此外，臨床試驗表明大約40%～50%的患者單獨使用別嘌醇達不到降低尿酸到目標水平[5]。苯溴馬隆具有潛在的肝臟毒性。丙磺舒可以與非甾體抗炎藥產生相互作用，臨床應用受到限制[6]。因此，研究和開發既能有效降低患者血尿酸水平，又能延緩高尿酸血癥腎損害（hyperuricemic nephropathy，HN）發生發展的藥物，且不良反應少的藥物是極具可行性且必要的一項研究。

白芍是我國傳統中藥材，近年來，科研人員將白芍作為保健食品進行了開發，例如張春婷等對以白芍作為主要原料的保健食品桂芍舒逸口服液進行了工藝優選，建立了質量標準[7]。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）為白芍干燥根中得到的芍藥苷（paeoniflorin）、羥基芍藥苷（hydroxy-paeoniflorin）、芍藥花苷（paeonin）、芍藥內酯苷（albiflorin）、苯甲酰芍藥苷（benzoylpaeoniflorin）等具有生理功效成分的混合物，具有消炎[8]、提高免疫功能[9]、保肝[10]、降脂[11]、降低空腹血糖[12]等作用。此外，TGP還可通過增加小鼠糞便含水量，提高腸動力改善便秘癥狀；調節小鼠腸道菌群結構，促進受損腸道屏障功能恢復[13-14]。

在腎臟方面，TGP可抑制系統性紅斑狼瘡小鼠血清中干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素6（interleukin 6，IL6）和IL12的表達及dsDNA水平，同時減輕小鼠的腎損傷，抑制小鼠的自身免疫[15]。Lv[16]發現，馬錢子總生物堿具有腎臟毒性作用，使大鼠腎臟血尿素氮和肌酐水平明顯升高，腎小管上皮細胞渾濁腫脹、變性，腎小球萎縮，TGP可以減弱TAS的吸收，加速其清除，減輕上述損害。本研究制造了HN模型，通過每兩周眼眶取血的方式，動態的觀察大鼠體重、血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指標，然后對腎進行形態學觀察，考察和評價TGP對HN大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性SD大鼠50只 體重220±10 g，6±1周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2020-030；每只大鼠分籠飼養于成都醫學院科研實驗中心，許可證號：SYXK（川）2020-196，飼養環境為室溫22±2 ℃、濕度55%±5%、12 h光照～12 h黑暗交替。氧嗪酸鉀（批號：H2017151） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腺嘌呤（批號：C11001521） 上海麥克林生化科技有限公司；白芍總苷膠囊（0.3 g/粒，每粒含芍藥苷不少于104 mg；批號：200512） 寧波立華制藥有限公司；別嘌醇片（批號：20020602） 萬全萬特制藥有限公司；肌酐試劑盒（批號：20201106）、尿素氮試劑盒（批號：2020-1105）、尿酸試劑盒（批號：202001104） 南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒（批號：20200829）、PAS染色試劑盒（批號：20201111）、中性樹膠（批號：330A023） 北京索萊寶科技有限公司。

Centrifuge 5415D小型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；CP225D精密分析天平 德國Sartorious公司；Varioskan Flash酶標儀 美國Thermo公司；BX63正置熒光顯微鏡顯微鏡 日本Olympus公司；Leica RM 2016超薄切片機 美國Feica公司；Specord 50 plus紫外分光光度計 德國耶拿分析儀器股份公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立 所有大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、TGP低、高劑量組和陽性藥物組，每組10只。每天上午7:00和晚上20:00，除正常組外，其余各組分別灌胃制備HN模型（腺嘌呤100 mg/kg+氧嗪酸鉀1500 mg/kg，用0.5%羧甲基纖維素鈉將兩者混合后制成混懸液[17]）。每天中午12:00，TGP低劑量組灌胃給予TGP 100 mg·kg-1·bw-1，TGP高劑量組灌胃給予TGP 300 mg·kg-1·bw-1，陽性藥物組灌胃給予別嘌醇27.0 mg·kg-1·bw-1，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天給藥1次，持續5周。

1.2.2 檢測指標及處理

1.2.2.1 取樣及樣品處理 每2周稱重，然后用眼眶取血方法，每只取血1 mL，然后37 ℃水浴30 min，5000 r/min離心15 min，取血清200 μL。

1.2.2.2 腎重及腎體比的測定 最后1次取血后，頸椎脫臼處死大鼠，取左右腎，分別稱重，計算雙腎重量與體重之比（腎體比）。

1.2.2.3 血清中尿酸、肌酐和尿素氮的檢測 參照試劑盒說明書，采用紫外分光光度計和酶標儀測定大鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮的水平。

1.2.2.4 腎小球和腎小管的病理檢測 用生理鹽水清洗后，浸泡在10%中性甲醛溶液中固定，常規脫水，石蠟包埋，切片厚3 μm，PAS染色光鏡下觀察腎小球有無病理變化，HE染色光鏡下隨機選擇10個無腎小球只有腎小管的視野，對腎小管間質損傷和腎臟炎性細胞浸潤進行半定量測定，評分標準見表1。利用BX63正置熒光顯微鏡拍照。

表1 腎小管間質損傷和腎臟炎性細胞浸潤評分標準[18]Table 1 Scoring criteria for tubulointerstitial injury and renal inflammatory cell infiltration[18]

1.3 數據處理

計量資料用 xˉ±s表示。應用SPSS 21.0軟件進行統計分析，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05表示差異有顯著性；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 大鼠的體重變化

結果見表2。與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠體重在第1、3、5周均極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，在第3周時，TGP高劑量組和別嘌醇組的體重顯著升高（P＜0.05），但在第5周時，TGP高、低劑量組和別嘌醇組與模型組的體重均無統計學差異，說明TGP并不能升高HN模型的體重。

表2 各組大鼠不同時間點體重的變化（g）Table 2 Changes of body weight of rats in each group atdifferent time points (g)

2.2 TGP對HN大鼠雙腎重與體重的比值的影響

腺嘌呤是制備HN模型的主要藥物之一，腺嘌呤會增加小鼠相對腎重、血漿尿素和肌酐濃度，降低體重，引起腎臟DNA損傷[19]。由表3可見，與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠左、右腎重量和腎體比均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP高、低劑量組和別嘌醇組的左、右腎重量和腎體比均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型的腎重和腎體比。

表3 各組大鼠左腎、右腎重量及腎體比情況Table 3 Weight of left kidney, right kidney and ratio of kidney to body of rats in each group

2.3 TGP對HN大鼠不同時間點血清中尿酸水平的影響

較高的尿酸水平會引發或者進一步發展腎損傷，導致急性和慢性腎臟疾病的發生，所以在臨床上，患有高尿酸血癥的患者需要檢測腎臟功能以便及時發現腎臟損傷[20-21]。由表4可見，與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠第1、3、5周血清中尿酸水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP低劑量組第1、3、5周血清中尿酸水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP高劑量組和別嘌醇組第1、3、5周血清中尿酸水平較模型組均極顯著降低（P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型血清中的尿酸水平，但并不能降低至正常水平。

表4 各組大鼠不同時間點血清中尿酸水平的變化（μmol/L）Table 4 Changes of serum uric acid level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.4 TGP對HN大鼠不同時間點血清中尿素氮水平的影響

血清中的尿素氮是從腎小球濾過再排出體外，當腎臟功能失代償時，血清中的尿素氮將升高，臨床通常將尿素氮作為判斷腎小球濾過功能的指標[22]。由表5可見，與正常組相比，HN模型的各組大鼠第5周血清中尿素氮水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP低劑量組和別嘌醇組第1、3、5周血清中尿素氮水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP高劑量組第3、5周血清中尿素氮水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型血清中的尿素氮水平，但并不能降低至正常水平。

表5 各組大鼠不同時間點血清中尿素氮水平的變化（mmol/L）Table 5 Changes of serum urea nitrogen level in rats of each group at different time points(mmol/L)

2.5 TGP對HN大鼠不同時間點血清中肌酐水平的影響

血清中肌酐水平是反映腎臟功能的重要指標，血清肌酐升高提示腎功能的損害[23]。急性腎損傷可導致短暫和持續的血清肌酐升高[24]。對于慢性腎臟病患者，血清肌酐是持續要監測的指標之一，血清肌酐含量越高，預后越差[25]。由表6可見，與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠第1、3、5周血清中肌酐水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP高劑量組和別嘌醇組第1、3、5周血清中肌酐水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP低劑量組第3、5周血清中肌酐水平較模型組出現極顯著降低（P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型血清中的肌酐至正常水平。

表6 各組大鼠不同時間點血清中肌酐水平的變化（μmol/L）Table 6 Changes of serum creatinine level in rats of each group at different time points (μmol/L)

2.6 TGP對HN大鼠腎小球病理的影響

尿酸升高會造成腎小球損傷，高尿酸會導致腎小球系膜細胞增殖，從而導致腎小球肥大和硬化[26-27]。由圖1可見，在400倍光鏡下可見，正常組腎小球結構完整，管壁薄，管腔開放，腎小球系膜細胞未見明顯異常改變。模型組腎小球出現了中度系膜細胞增生，增生的系膜細胞呈團塊狀聚集，部分毛細血管受擠壓。TGP低劑量組出現了輕度系膜細胞增生，TGP高劑量組和別嘌醇組未出現系膜細胞增生，說明TGP可緩解HN模型腎小球系膜細胞增生。

圖1 各組大鼠腎小球病理變化（PAS染色，400×，標尺=20 μm）Fig.1 Pathological changes of glomeruli in rats of each group (PAS staining, 400×, Bar=20 μm)

2.7 TGP對HN大鼠腎小管病理的影響

高尿酸會通過促進活性氧誘導腎小管細胞凋亡，也可誘導腎小管上皮細胞發生上皮-間充質轉化，最終導致腎小管間質纖維化[28-30]。由圖2可見，在400倍光鏡下可見，正常組腎小管形態正常，結構完整，排列整齊，腎小管間質無炎癥細胞浸潤。模型組有腎小管損傷，表現為腎小管擴張，腎小管間質有炎性細胞浸潤。由表7可見，TGP高、低劑量組和別嘌醇組可緩解腎小管擴張，減少腎小管間質損傷和腎臟炎性細胞浸潤（P均＜0.01）。

表7 各組大鼠腎小管間質損傷和腎臟炎性細胞浸潤評分比較Table 7 Comparison of tubulointerstitial injury and renal inflammatory cell infiltration score in rats of each group

圖2 各組大鼠腎小管病理變化（HE，400×, 標尺=20 μm）Fig.2 Pathological changes of renal tubules in each group (HE，400×, Bar =20 μm)

3 討論

近來的研究表明，TGP中的主要成分芍藥苷可明顯改善糖尿病腎病小鼠的臨床癥狀，通過抑制iNOS的表達以及TNF-α、IL-1β和MCP-1的產生而減少腎臟中浸潤的巨噬細胞數量而治療糖尿病腎病[31]。TGP可改善急性腎損傷大鼠血清中肌酐和尿素氮水平，增加腎細胞的活力，減輕腎臟細胞凋亡和抑制炎癥反應[32]。由此可見，TGP對腎臟發揮著保護作用，但是目前的研究大多停留在研究TGP改善急性腎損害或者糖尿病所致的腎損害方面，對TGP改善高尿酸血癥所致的慢性腎損害的研究尚無相關報道。

本課題組研究發現，TGP能降低HN模型的腎重、腎體比，降低HN模型血清中的尿酸、尿素氮和肌酐水平，緩解HN模型腎小球系膜細胞增生，緩解腎小管擴張，減少腎小管間質損傷和腎臟炎性細胞浸潤，從而對HN大鼠的腎臟有一定的保護作用。本實驗采用別嘌醇作為陽性對照藥物，研究結果表明TGP與別嘌醇具有相似的治療HN的作用，但TGP作為一種天然產物，服用安全，因此TGP在改善HN方面具有一定的應用開發潛力。今后可更深層次的研究TGP對HN的相關基因表達水平的影響。