驢骨膠原蛋白肽對骨質(zhì)疏松大鼠的改善作用

周廣運，樊雨梅，劉楚怡，廖 峰，張筱梒，李八方,

（1.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心/東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252200；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266001）

驢骨是驢屠宰后的副產(chǎn)物，約占驢總重量的10%。目前，大多數(shù)的驢骨被廢棄，只有少部分被加工成骨粉或骨泥等附加值較低的產(chǎn)品[1]。分析驢骨的化學(xué)組成可知，驢骨中蛋白質(zhì)的含量可達25%[2]，且主要組成蛋白為膠原蛋白。膠原蛋白作為一類結(jié)構(gòu)特殊的蛋白，在美容、醫(yī)藥及食品中都有著廣泛的應(yīng)用[3-5]，但同時作為大分子蛋白，膠原蛋白只有在人體內(nèi)逐步分解為氨基酸才能被吸收利用。而肽作為蛋白質(zhì)的中間水解產(chǎn)物之一，與蛋白質(zhì)相比較，能被人體更好地消化吸收利用，同時，相關(guān)研究也表明小分子肽還具有多種調(diào)節(jié)人體生理功能的作用[6-8]。

骨質(zhì)疏松是中老年人常見的一種病癥，主要表現(xiàn)為骨質(zhì)量下降、骨脆性增加、易骨折等[9]。目前用于改善和治療骨質(zhì)疏松的方法包括藥物干預(yù)及營養(yǎng)補充劑等，但由于藥物治療存在著一定的副作用，越來越多的患者將營養(yǎng)補充劑作為首選。在營養(yǎng)補充劑的使用報道中，除含鈣類物質(zhì)使用較普遍外，膠原蛋白肽類抗骨質(zhì)疏松的研究報道也備受關(guān)注[10-12]。

驢骨膠原蛋白肽（donkey bone collagen peptide，DBCP）是驢骨膠原蛋白水解后的產(chǎn)物，由于驢資源的稀缺和珍貴，關(guān)于DBCP的功效研究報道很少，其中劉楚怡等[13]開發(fā)了一種不同分子量抗骨質(zhì)疏松驢骨肽的制備工藝，但具體的生理作用效果并未作研究。相關(guān)研究也表明不同分子量的膠原蛋白肽在理化、功能及吸收方面都存在著較大的差異[14-16]。對此，本研究以劉楚怡等[13]的驢骨活性肽制備工藝為基礎(chǔ)，對相關(guān)制備方法進行了優(yōu)化，重點研究了不同分子量DBCP對改善骨質(zhì)疏松的功效作用，以期為DBCP的功效證實、擴展及產(chǎn)品開發(fā)轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨膠原蛋白 東阿阿膠股份有限公司；SD大鼠 SPF級（動物許可證號SCXK（魯）20140007），濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；血清鈣檢測試劑盒、血磷檢測試劑盒、TNF-αELISA檢測試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、氯化鈉 分析純，北京化學(xué)試劑公司；胰蛋白酶 食品級，南京龐博公司；青霉素、乙醚、PBS緩沖液 生物級，美國Gibico公司。

AY220電子分析天平 日本島津公司；VORTEX 1圓周振蕩搖床 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；TS-1渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL-20B高速冷凍離心機 上海安亭實驗儀器廠；pHS-3C精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SY21-NI4V恒溫水浴鍋 北京長風(fēng)儀器儀表公司；UV-2010PC紫外分光光度計 上海尤尼克儀器有限公司；SM-2.8-10型馬弗爐 天津市華北實驗電爐廠；BH-2顯微鏡 Olympus公司；680型全自動酶標(biāo)儀 美國BIORAD公司；GK99-UNIGAMMA XRAY PLUS雙能X射線骨密度儀 北京中西遠大科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同分子量DBCP的制備 參考劉楚怡等[13]不同分子量DBCP的制備方法。以驢骨膠原蛋白為原料，采用胰蛋白酶進行酶解，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH，具體制備工藝條件見表1。酶解結(jié)束后，95 ℃條件下滅酶活，得到的酶解產(chǎn)物過濾去雜，并進行0.8 μm抽濾膜超濾，最后將溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，倒入玻璃平板凍干。

表1 不同分子量驢骨膠原蛋白肽的制備工藝條件Table 1 Preparation conditions of donkey bone collagen peptides with different molecular weights

1.2.2 大鼠骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建 本研究參考較常用的去卵巢手術(shù)法構(gòu)建大鼠的體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型[12]。選取健康的SPF級雌性SD大鼠，體重200±20 g，全部動物適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后，將動物隨機分為假手術(shù)組和去卵巢手術(shù)組。大鼠去卵巢操作：首先將大鼠麻醉仰臥固定，于腹中線兩側(cè)處去毛，并使用75%酒精消毒，待稍干后做縱形切口，切開皮膚和腹?。恢蟠蜷_腹腔，撥開脂肪層找到子宮角，沿子宮角方向向上將其盡頭處的組織輕輕拉出，分離脂肪，即可找到被脂肪包裹的卵巢組織；用止血鉗夾在卵巢與子宮角末端位置，使用手術(shù)線結(jié)扎后，將卵巢組織及其連帶的脂肪全部切除，然后將剩余子宮角送回腹腔；最后將腹肌和皮膚分層進行縫合后，傷口處灑適量青霉素鈉溶液進行消毒。同法剪除另一側(cè)卵巢。假手術(shù)組大鼠僅打開腹腔后摘除少量脂肪組織。

1.2.3 動物分組及配方飼喂 手術(shù)后4周，將接受去卵巢手術(shù)的大鼠隨機分為7組，其中1～6組為受試樣品組，第7組為陰性對照組，假手術(shù)大鼠設(shè)為第8組，總計8組，每組10只。大鼠飼料的配制參照AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配方（見表2），其中3種不同分子量的DBCP各設(shè)2個劑量組，DBCP分別占比2%和4%。1～6組按照A～F飼料配方喂養(yǎng)，陰性對照組和假手術(shù)組按照G配方喂養(yǎng)，實驗期間動物自由飲用蒸餾水。大鼠按各配方飼喂12周，期間觀察大鼠活動、飲食等一般狀況，每周稱量體重一次。

表2 不同分子量驢骨膠原蛋白肽飼料配方Table 2 Formula of donkey bone collagen peptide with different molecular weights

1.2.4 大鼠子宮指數(shù)及形態(tài)觀察 喂養(yǎng)結(jié)束后，大鼠放血處死，取出子宮器官，仔細清除周圍結(jié)締組織并立即稱重，計算子宮指數(shù)。之后，將子宮置于中性甲醛溶液中固定，流水沖洗，對子宮樣本進行常規(guī)石蠟包埋并切片染色。染色采用蘇木精-伊紅染色法，染色流程為：切片復(fù)水后，蘇木素染液染色5 min，用1%的鹽酸-乙醇分色，水洗15 min左右；伊紅染液染60 s，95%的酒精和100%的酒精各分色3 min，二甲苯中脫水完全，中性樹膠封片。最后使用光學(xué)顯微鏡對各組大鼠子宮形態(tài)變化進行觀察。

1.2.5 血清樣本的處理及生化指標(biāo)的測定 大鼠飼喂12周，末次喂養(yǎng)后，各組禁食不禁水12 h。將大鼠用乙醚麻醉后進行腹主動脈取血，血液于室溫靜置30 min后，于4 ℃、4000 r/min條件下離心15 min，分離得到的血清-80 ℃貯存。血清樣本解凍后渦旋振蕩混勻，按照各試劑盒說明書檢測血清樣本中各基本指標(biāo)含量，包括血鈣、血磷、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮、堿性磷酸酶、腫瘤壞死因子和雌二醇等。

1.2.6 大鼠股骨與脛骨分離處理 沿大鼠關(guān)節(jié)走向，小心將雙側(cè)股骨與脛骨取下，并用剪刀及紗布剔凈附著于骨上的肌肉與結(jié)締組織。使用生理鹽水浸泡過的紗布將右側(cè)股骨樣本包裹，使其保持濕潤，置于-80 ℃冰箱保存，用于骨密度檢測；左側(cè)股骨樣本置于-80 ℃冰箱保存，備用。右側(cè)脛骨樣本置于中性甲醛溶液中固定備用，用于制作骨切片；左側(cè)脛骨樣本快速清理后保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.7 大鼠股骨骨密度測定 將大鼠股骨樣本取出，去除包裹樣本所用的紗布，將保持濕潤的股骨樣本放于測試臺水膜之上，使用雙能X射線骨密度儀對樣品進行掃描，掃描時切換至小動物模式。掃描結(jié)束后使用配套軟件對股骨樣本的骨密度進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05或P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠的安全性評價

2.1.1 DBCP對大鼠體重的影響 體重能夠在一定程度上反映出生物體的健康狀況，樣品飼喂期間各組大鼠的體重變化如圖1所示。

由圖1可知，隨著整個實驗過程的進行，各組大鼠的體重均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。不同組間比較，去卵巢的陰性對照組大鼠體重增加速度明顯高于假手

圖1 各組大鼠體重隨喂養(yǎng)時間的變化情況Fig.1 Changes of body weight of rats in each group with feeding time

術(shù)組，這主要為大鼠去卵巢后，自主活動減少致體重增加，即去卵巢手術(shù)對大鼠體重的增加有一定的激發(fā)作用，這與相關(guān)文獻報道相一致[17]。自第8周起，所有實施去卵巢手術(shù)組的大鼠體重與假手術(shù)組相比，均呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。進行至第12周時，六組DBCP組與去卵巢陰性對照組相比，均不存在顯著性差異，這表明DBCP不會引起去卵巢大鼠體重的顯著變化，即DBCP不能逆轉(zhuǎn)摘除卵巢對大鼠體重產(chǎn)生的代償性肥胖。

2.1.2 DBCP對大鼠子宮的影響 大鼠去卵巢后，由于雌激素水平的降低，會使子宮發(fā)生萎縮等現(xiàn)象。喂養(yǎng)結(jié)束后，在對大鼠的解剖過程中，可明顯看出假手術(shù)組大鼠子宮形態(tài)飽滿，子宮角粗大且顏色紅潤健康；而摘除卵巢的大鼠子宮萎縮、子宮角變細，色澤泛白，可比較直觀地判斷出去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型造模成功。數(shù)據(jù)比對方面，子宮指數(shù)作為評價子宮變化的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一，DBCP對大鼠子宮指數(shù)的影響結(jié)果如圖2所示。與假手術(shù)組相比，去卵巢后的大鼠子宮指數(shù)均呈現(xiàn)極顯著性降低（P＜0.01），說明去卵巢手術(shù)成功，大鼠骨質(zhì)疏松模型造模成功，可用于受試物評價。而與陰性對照組相比，樣品組大鼠子宮指數(shù)雖有一定程度的下降，但差異不顯著（P＞0.05），說明受試樣品均不能改善去卵巢所致的子宮萎縮現(xiàn)象，同時也說明各樣品均不會對大鼠體內(nèi)雌激素的分泌產(chǎn)生影響，長期食用不會引起副作用。

圖2 DBCP對大鼠子宮指數(shù)的影響Fig.2 Effect of DBCP on uterine index in rats

為了更好地觀察大鼠子宮的變化，分別對各組大鼠子宮進行了切片染色，觀察結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯觯杭偈中g(shù)組子宮壁細胞形態(tài)飽滿，且子宮內(nèi)膜較厚，去卵巢組的子宮內(nèi)膜壁顯著變薄，且發(fā)生了明顯的萎縮。而六組DBCP均未對去卵巢大鼠的子宮形態(tài)產(chǎn)生顯著性影響，切片結(jié)果均與陰性對照組類似。因此，可判定各樣品組均不能改善由去卵巢所致的子宮萎縮現(xiàn)象，對子宮的形態(tài)及質(zhì)量亦均無顯著性作用。此研究結(jié)果與DBCP對大鼠子宮指數(shù)的影響相一致。

2.1.3 DBCP對大鼠肝功能的影響 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）和 谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶（Aspartate aminotransferase，AST）是評價肝功能受損的重要指標(biāo)，可指示急性肝細胞的損傷。圖4展示了DBCP對大鼠ALT和AST活力的影響。由圖可知，各組間ALT、AST酶活力均未見顯著性差異（P＞0.05），可判定DBCP不會引起大鼠肝功能的損傷。

圖4 DBCP對大鼠ALT和AST酶活力的影響Fig.4 Effect of DBCP on ALT and AST activities in rats

2.1.4 DBCP對大鼠腎功能的影響 血清尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）由腎小球濾過排出，正常BUN參考值為：2.9～7.5 mmol/L，腎功能不全時，BUN將升高。圖5顯示了DBCP對大鼠BUN含量的影響，與假手術(shù)組相比，陰性對照組大鼠BUN含量呈現(xiàn)極顯著性升高（P＜0.01），但仍在正常值范圍內(nèi)；而各組DBCP與陰性對照組相比，除1～3 kDa 2% DBCP和＞3 kDa 4% DBCP外，BUN含量均呈現(xiàn)極顯著性下降（P＜0.01），說明DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠腎小球濾過功能有一定的促進作用。

圖5 DBCP對大鼠BUN含量的影響Fig.5 Effect of DBCP on BUN content in rats

肌酐（Creatinine，Cr）通常也作為評價腎臟的功能性指標(biāo)，DBCP對Cr含量的影響如圖6所示。由圖6可知，與假手術(shù)組相比，各組大鼠的Cr含量均未見顯著性差異（P＞0.05）。說明去卵巢手術(shù)和各組DBCP喂養(yǎng)均不會對大鼠Cr含量帶來顯著性影響。

圖6 DBCP對大鼠Cr含量的影響Fig.6 Effect of DBCP on Cr content in rats

綜上所述，受試樣品DBCP各劑量組均不會顯著影響大鼠的體重、子宮指數(shù)及肝腎功能，DBCP能夠作為安全的天然補充劑長期服用。

2.2 DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響

骨質(zhì)疏松可能會對大鼠血清中與骨轉(zhuǎn)換相關(guān)的一系列生化指標(biāo)產(chǎn)生影響，為呈現(xiàn)DBCP作用效果，對各組大鼠的血清相關(guān)生化指標(biāo)進行了檢測分析。

2.2.1 DBCP對大鼠堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活力的影響 ALP是衡量成骨細胞活性的重要指標(biāo)，具體的DBCP對大鼠ALP活性的影響見圖7。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，陰性對照組大鼠的ALP酶活力呈現(xiàn)極顯著提升（P＜0.01），添加受試樣品后，＜1 kDa、1～3 kDa、＞3 kDa三個分子量的DBCP高劑量組與陰性對照組相比，均呈現(xiàn)極顯著性降低（P＜0.01），與假手術(shù)組的ALP活性處于同一水平。此研究結(jié)果與Zhang等[18]的研究結(jié)論相一致，主要原因為去卵巢后雌激素減少，使得骨吸收亢進，出現(xiàn)代償性骨形成增加，而飼喂DBCP干預(yù)后，代償性反應(yīng)減弱，抑制了破骨細胞活性，抑制了骨吸收，從而使得ALP活性降低。

圖7 DBCP對大鼠ALP酶活力的影響Fig.7 Effect of DBCP on ALP activity in rats

2.2.2 DBCP對大鼠腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）的影響 TNF-α能夠刺激破骨細胞的形成，反應(yīng)骨吸收狀況。圖8顯示了DBCP對大鼠TNF-α活性的影響。與假手術(shù)組相比，陰性對照組大鼠的TNF-α酶活力呈現(xiàn)極顯著提高（P＜0.01），說明去卵巢后骨吸收功能增強，骨形成增加，骨代謝處于高轉(zhuǎn)換的狀態(tài)，這也反映出去卵巢手術(shù)能夠誘導(dǎo)高骨轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥的形成。添加受試樣品后，＜1、1～3、＞3 kDa三個分子量的DBCP高劑量組與陰性對照組均有顯著性差異（P＜0.05），證明三種分子量的高劑量DBCP均能夠抑制去卵巢后代謝失衡對于骨吸收和骨形成的提高作用，緩解去卵巢后的高骨轉(zhuǎn)換癥狀和骨質(zhì)疏松癥狀。此結(jié)果與DBCP對大鼠ALP活力的影響相呼應(yīng)。

圖8 DBCP對大鼠TNF-α活力的影響Fig.8 Effect of DBCP on TNF-α activity in rats

2.2.3 DBCP對大鼠雌二醇（Estradiol，E2）含量的影響 相關(guān)研究表明[19]，雌二醇（E2）水平的降低，會造成骨轉(zhuǎn)換平衡的打破，最終使骨鈣代謝成為負平衡，骨量減少。在本研究中，分別檢測了各組大鼠的E2含量變化，如圖9所示。與陰性對照組相比，雖然各受試樣品組E2均有不同程度的提高，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，均無顯著性差異（P＞0.05），這表明DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠E2單一指標(biāo)的作用不明顯。

圖9 DBCP對大鼠E2含量的影響Fig.9 Effect of DBCP on E2 Content in rats

2.2.4 DBCP對大鼠血鈣、血磷含量的影響 血鈣和血磷是與骨礦化有關(guān)的指標(biāo)。如圖10所示，與假手術(shù)組相比，陰性對照組大鼠的血鈣和血磷含量均呈現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05）；而與陰性對照組相比，＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP組的血鈣和血磷含量則均呈現(xiàn)出顯著性升高（P＜0.05）。這表明：＜1 kDa DBCP和1-3 kDa DBCP對于骨質(zhì)疏松大鼠有較好的提高其體內(nèi)鈣、磷水平，促進鈣、磷沉積，增強體內(nèi)成骨細胞增殖的作用，此研究結(jié)果與Liu等[11]的研究相一致。

圖10 DBCP對大鼠血鈣和血磷含量的影響Fig.10 Effects of DBCP on blood calcium and phosphorus content in rats

2.3 DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠骨指標(biāo)的影響

2.3.1 DBCP對大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響 圖11反映了各組大鼠脛骨的組織形態(tài)學(xué)變化，可以看出假手術(shù)組大鼠脛骨骨小梁是完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)較為緊密。而摘除卵巢后的陰性對照組大鼠的骨小梁數(shù)目明顯減少，且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁間的空隙也明顯變大，另外脛骨部分區(qū)域還出現(xiàn)了骨質(zhì)斷裂的現(xiàn)象，這是骨質(zhì)疏松的典型病變。而在飼喂DBCP的各組大鼠中，與陰性對照組相比，其結(jié)構(gòu)得到了一定的恢復(fù)，骨連接狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，間隙更小，無骨質(zhì)斷裂等狀況，說明DBCP對改善骨質(zhì)疏松癥狀具有一定的作用。

圖11 DBCP對大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.11 Effects of DBCP on bone histomorphology in rats

2.3.2 DBCP對大鼠骨密度（Bone mineral density，BMD）的影響 BMD是骨質(zhì)疏松癥的重點考察指標(biāo)[20-21]，為使BMD數(shù)據(jù)更具代表性，分別對各組大鼠的總股骨、股骨前端、股骨骨干及骨骺端4個部位進行了BMD數(shù)據(jù)測定，具體結(jié)果見表3?？梢钥闯觯c陰性對照組相比，除＞3 kDa 2% DBCP組外，其余各樣品組的BMD均顯著性升高（P＜0.05），其中＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP的兩個劑量組BMD與假手術(shù)組間已無顯著性差異（P＞0.01），即＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP可使去卵巢大鼠BMD恢復(fù)至未去除卵巢水平，即能有效的緩解骨質(zhì)疏松癥狀。而＞3 kDa 2% DBCP作用效果不明顯可能與肽純度及分子量相對較大有關(guān)，影響到了肽的消化吸收效率；而增加劑量至4%時，伴隨著劑量的增加，肽的吸收起到了一定的累積，達到了作用效果。

表3 DBCP對大鼠BMD的影響Table 3 Effect of DBCP on BMD in rats

3 結(jié)論

本研究以動物體內(nèi)實驗的形式探究了不同分子量的DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠的改善作用。結(jié)果表明：各實驗組大鼠生長活動良好，肝腎功能等指標(biāo)均未見異常，表明DBCP作為天然產(chǎn)物無明顯副作用；三種分子量（＜1 kDa、1～3 kDa、＞3 kDa）的高劑量組（4%）DBCP均能夠不同程度下調(diào)血清中ALP酶活力和TNF-α的含量，即能夠抑制去卵巢后由于代謝失衡對于骨吸收和骨形成的提高作用，緩解去卵巢后的高骨轉(zhuǎn)換癥狀和骨質(zhì)疏松癥狀；＜1 kDa DBCP和1～3 kDa DBCP對骨質(zhì)疏松大鼠有較好的提高其體內(nèi)鈣、磷水平的作用，并可使去卵巢大鼠BMD恢復(fù)至未切除卵巢水平，即能夠有效地緩解骨質(zhì)疏松癥狀。

本研究結(jié)果的提出，充分論證了驢骨膠原蛋白肽緩解骨質(zhì)疏松的功效作用，豐富了骨膠原蛋白肽的功效研究成果，并為驢骨膠原蛋白肽類產(chǎn)品的開發(fā)及功能宣稱提供了理論依據(jù)。但同時膠原蛋白肽在推廣應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)方面也面臨著一些問題，例如：不同分子量的膠原蛋白肽與功效間的關(guān)系、不同來源的膠原蛋白肽的功效研究論證以及法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)不健全等。雖然存在著一些問題，但伴隨著肽制備及分離純化工藝的逐步成熟、新技術(shù)研究手段的升級以及相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的完善，膠原蛋白肽仍具有較廣闊的發(fā)展空間。