低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉品質及組織蛋白酶H活性變化

李志鵬，周曉嬌，水珊珊，HATAB Shaimaa Reda Abd Elkhalik，張 賓,

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022；2.赫利奧波利斯大學食品加工系，埃及開羅 11785）

中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis），俗稱紅蝦，因其蝦殼通透、肉質糯軟，富含大量人們健康飲食所需的營養物質，而備受消費者的歡迎。中華管鞭蝦捕撈點主要分布于印度、馬來西亞、印度尼西亞、日本和中國沿海[1]。在我國，常見于黃海南部和東海附近，適宜的捕撈期為5月～8月，在5月捕獲量最高。近年來，隨著水產品銷售量的日益增多，以及人們對新鮮高質量水產品的需求增大，中華管鞭蝦等蝦類逐漸變為世界上最重要的漁業產品[2]。但冰鮮蝦類在貯藏過程中容易腐敗，尤其在長距離運輸過程中蝦肉口感及品質劣變更為嚴重。如何有效解決冰鮮蝦類的貯藏品質劣變問題，對保障蝦類制品價值及滿足消費者需求具有重要意義。

研究表明，蝦體肌肉軟化可能由多種原因造成。在冷藏或凍藏條件下，蝦體肌肉組織中冰晶的形成和細胞體積的變化，會導致細胞和肌纖維被破壞，進而導致蝦肉的軟化[3]。于麗霞等[4]研究了羅氏沼蝦凍藏過程中冰晶形成情況，發現羅氏沼蝦在冰箱中形成冰晶顆粒較大，其對細胞產生的機械損傷作用嚴重。此外，蝦肉中的組織蛋白酶會隨著貯藏時間的延長不斷作用于肌肉蛋白質，導致細胞骨架和肌原纖維蛋白被破壞。近年來，組織蛋白酶對水產品品質的影響逐漸被人們所關注，尤其在水產動物死后貯藏初期，其肌肉品質往往會發生極大的改變，組織蛋白酶被認為是對肌肉蛋白質產生降解的重要影響因素[5]。沈春蕾等[6]研究發現，在凡納濱對蝦貯藏過程中，蝦頭中部分蛋白酶可能會逐步遷移到蝦肌肉中，進而對肌肉品質產生較大影響。目前，對于不同貯藏方式下蝦肌肉組織中內源酶活性對其肌肉品質變化產生的影響，還存在較多不明之處，尤其關于中華管鞭蝦等海水蝦類中組織蛋白酶活性的研究還鮮有報道[7-8]。本研究以完整的中華管鞭蝦為對照組，比較分析去頭后的蝦肌肉組織理化特性及組織蛋白酶H活性變化情況，旨在為后續海水蝦類組織蛋白酶活性及其貯藏方式的選擇提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮中華管鞭蝦（體長13～15 cm） 浙江舟山中國舟山國際水產城，購買后立即放入裝有冰袋的保溫箱內，快速運回實驗室，并立即對其進行處理；磷酸氫二鈉、三（羥甲基）氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, SDS）、過硫酸銨（Ammonium persulphate, APS）、Na2EDTA、焦磷酸鈉等 國藥集團化學試劑有限公司；蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；組織蛋白酶H測定試劑盒 上海繼錦化學科技有限公司。

751UVGD型紫外-可見光分光光度計 上海第三分析儀器廠；MS-Pro型物性測試儀 美國FTC公司；Synergy H1全功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；HSY-A-200恒溫水浴振蕩器 天津廠草科技有限公司；DiRECT-Q超純水裝置 美國MILLIPORE公司；MDF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將實驗樣品分為2組：完整蝦組和去頭蝦組，分別進行4 ℃冷藏（貯藏6 d，每2 d取樣測定1次）和-18 ℃凍藏（貯藏120 d，每20 d取樣測定1次）。

1.2.2 pH的測定 依據GB/T 5009.237-2016方法進行測定。選取多只蝦的第二腹節，混合后切碎，稱取3 g樣品（精確到0.01 g），加入10倍煮沸后冷卻的蒸餾水，高速均質30 s，搖勻后靜置30 min，過濾，取濾液。用pH計測量數值，每組實驗平行重復三次，取平均值。

1.2.3 持水力的測定 參考盧涵[9]的實驗方法，并稍作改進。選取多只蝦的第二腹節，混合后切碎，稱取2 g左右蝦肉（重量記作W1，g），用濾紙包裹，1600×g離心10 min后，再次稱重（重量記作W2，g）。持水力表示樣品保持重量的百分比，計算公式如（1）所示。

1.2.4 肌原纖維蛋白含量的測定 測定方法參考李學鵬等[10]報道，并稍作修改。選取多只蝦的第二腹節，混合后切碎，稱取3 g樣品，加入5倍體積10 mmol/L Tris-HCl（pH7.2）緩沖溶液，高速均質30 s后，4 ℃條件下5000 r/min離心10 min，取沉淀。重復以上操作3次，在最后一次沉淀中加入5倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl；pH7.2），取上清液即為制備的肌原纖維蛋白溶液，其含量采用考馬斯亮藍法進行測定。

1.2.5 質構特性的測定 參照祁雪兒等[11]實驗方法，并稍作修改。選用TPA測量模型，測定蝦肉硬度和彈性。設定參數為：P/50探頭，測試前速度120 mm/min，測試速度60 mm/min，測后速度60 mm/min，測定部位中華管鞭蝦第二腹節，樣品形變量50%。采用FTC-PRO軟件對蝦肌肉產生的力和時間曲線進行分析，計算蝦肉彈性和硬度。

1.2.6 水分含量的測定 參照GB 5009.3-2016直接干燥法，選取多只蝦的第二腹節，混合后切碎，稱取2 g樣品（精確至0.0001 g）置于101～105 ℃烘箱中，通過干燥前、后重量變化，計算蝦肌肉中水分含量。

1.2.7 亞細胞各組分的分離 參照邱恒恒[12]和李樹紅[13]報道方法，并稍作改進。選取多只蝦的第二腹節，混合后切碎，取2 g蝦肉，加入5倍體積緩沖液A（含100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L Na4P2O7和1 mmol/L Na2EDTA；pH7.2），混合均質1 min；采用三層尼龍網過濾去除結締組織，濾液采用差速離心法分離獲得肌原纖維（4 ℃，1100×g，持續10 min），線粒體（4 ℃，3000×g，持續15 min）和溶酶體（4 ℃，16000×g，持續30 min）；溶酶體經離心后所得上清液即為肌漿部分。將以上制備的各亞細胞組分，加入貯藏液B（含85 mmol/L CH3COONa，15 mmol/L CH3COOH以及1 mmol/L EDTA-2Na）后，立即檢測組織蛋白酶H的活性。

1.2.8 組織蛋白酶H的酶活性的測定 采用試劑盒法測定各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性，操作過程依據試劑盒使用說明書進行。

1.2.9 SDS-PAGE分析 參照Laemmli[14]的方法，組裝好已經清洗晾干的電泳槽各部件，檢查是否漏水，待用。實驗采用12%的分離膠及5%的濃縮膠，電極緩沖液含0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS（pH8.3）。電泳采用1 mm凝膠板；標準蛋白標記（11～245 kDa）；上樣量為10 μL；電泳初始電壓為80 V，待樣品進入分離膠后改為120 V；電泳結束后，用考馬斯亮藍染色30 min，然后用不同比例的甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明。電泳膠片置于凝膠成像儀攝像，結合Tanon軟件進行分析和處理。

1.3 數據處理

以上樣品測定均平行重復三次（n=3）。采用SPSS 17.0進行數據分析，不同處理組之間的差異性分析，采用多重比較分析法（Duncan法，P＜0.05）。采用Origin 8.0對結果數據進行制圖分析。

2 結果與分析

2.1 低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉pH變化情況

pH是水產品鮮度評價的重要指標之一[15]。如圖1所示，隨著貯藏時間延長，完整蝦和去頭蝦肌肉pH均呈不斷上升的趨勢。在0～6 d冷藏過程中，完整蝦和去頭蝦肌肉pH分別從初始的7.05和7.08上升到7.82和7.65；在凍藏第120 d，二者肌肉pH分別上升至8.01和7.82。在低溫貯藏過程中，外界污染微生物生長及其代謝產物、蝦體內內源酶作用等造成肌肉蛋白質降解及氧化分解，致使肌肉中產生了氨和胺等堿性物質，因此導致了蝦肌肉pH的上升[16-17]。在貯藏后期，完整蝦組肌肉pH顯著高于去頭蝦組（P＜0.05），可能是由于隨著貯藏時間延長，蝦頭中部分內源性蛋白酶遷移到肌肉組織，加快了蝦肌肉蛋白質的降解速率，使其pH高于去頭蝦組[6]。

2.2 低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉持水力變化情況

肌肉持水力表示肌肉組織阻礙其水分流失的能力，通常采用離心前后肌肉組織重量差表示其持水力的大小，即肌肉組織在離心過后重量變化大，則表示肌肉的持水能力較差[18]。如圖2所示，隨著貯藏時間延長，完整蝦和去頭蝦組肌肉持水力均呈現出不斷下降的趨勢，且在貯藏后期，去頭蝦肌肉持水力均顯著高于完整蝦組（P＜0.05）。貯藏第0 d，蝦肉持水力為77.70%；經冷藏6 d后，完整蝦和去頭蝦組肌肉持水力分別下降至65.87%和68.20%；而經凍藏120 d，二者分別下降至60.28%和64.83%，同時在40～120 d凍藏期內，肌肉持水力下降速率較快。在低溫貯藏過程中，肌肉持水力的快速降低，可能主要是由于肌肉中內源蛋白酶（如組織蛋白酶H和D、鈣蛋白酶及胰蛋白酶等）作用于肌原纖維蛋白，導致肌原纖維降解及收縮加劇，致使組織中相鄰纖維之間空間變大，其中水分通過形成毛細管作用而不斷流失[19]。Zhang等[20]研究也證實，肌肉中組織蛋白酶活性的大小和肌原纖維的分解程度密切相關，正是由于組織蛋白酶酶解作用導致了肌肉持水能力的降低。此外，在凍藏過程中，肌肉中內源酶活性雖受到一定程度的鈍化或抑制，但凍結形成的冰晶顆粒擠壓破壞肌纖維物理結構，也導致了肌肉組織持水能力的快速降低。在本實驗中，尤其在冷藏及凍藏后期，去頭蝦肌肉組織持水力均顯著優于完整蝦組（P＜0.05），這可能是由于蝦頭部存在大量內源酶對蝦肌肉品質產生較大的影響；在較長貯藏期內，可能存在著某種遷移機制，進而影響蝦肌肉組織的持水力等功能特性。

圖2 冷藏（a）和凍藏（b）條件下中華管鞭蝦肌肉持水力變化情況Fig.2 Changes of water holding capacity of red shrimp muscle during cold storage (a) and frozen storage (b)

2.3 低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉肌原纖維蛋白含量變化情況

肌原纖維蛋白在蝦肌肉中含量最高，在某種程度上其含量的高低即可表明蝦肉品質變化情況[21]。如圖3所示，隨著貯藏時間延長，中華管鞭蝦肌肉中肌原纖維蛋白含量一直呈下降趨勢。貯藏第0 d時，蝦肉中肌原纖維蛋白含量為57.42 mg/g；在0～4 d冷藏過程內，其下降速率較快，4～6 d時下降幅度逐漸減弱，在6 d時完整蝦和去頭蝦組肌肉肌原纖維蛋白含量分別下降了38.32%和30.88%；在0～20 d凍藏過程內，其含量下降幅度較大，20～80 d時呈線性下降趨勢，最后趨于平緩，而在凍藏120 d后，二者分別下降了61.67%和52.09%。這可能是由于隨著貯藏時間的延長，蝦肌肉中組織蛋白酶分解了肌原纖維蛋白，使得其蛋白含量逐漸下降[13]。在冷藏和凍藏后期時，完整蝦組的肌原纖維蛋白含量均顯著低于去頭蝦組（P＜0.05），可能是由于實驗中蝦頭內部分內源酶發生遷移，使得完整蝦肌肉中組織蛋白酶活性高于去頭蝦組，導致其肌原纖維蛋白降解速率比去頭蝦組快[18]。

圖3 冷藏（a）和凍藏（b）條件下中華管鞭蝦蝦肉肌原纖維蛋白變化情況Fig.3 Changes of myofibrillar protein of red shrimp muscle during cold storage (a) and frozen storage (b)

2.4 低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉硬度和彈性的變化情況

硬度和彈性是影響水產品質構特性的主要因素，在貯藏過程中，肌肉間結合力的大小和肌纖維損傷，會導致肌肉的彈性和硬度發生改變[22]。如表1所示，貯藏第0 d，完整蝦和去頭蝦組肌肉硬度分別為19.24和19.33 N；經冷藏至6 d時，二者分別下降至16.12和17.31 N；經凍藏至120 d時，二者分別下降至16.73與18.50 N。貯藏第0 d時，完整蝦和去頭蝦組肌肉的彈性為2.01和1.98 mm；冷藏至6 d時，其肌肉彈性分別降至1.24和1.38 mm；凍藏至120 d時，二者分別降至1.70和1.77 mm。隨著冷藏周期的延長，蝦肌肉的硬度和彈性均呈現不斷下降的趨勢，而在凍藏期間其硬度和彈性出現了先上升后下降的趨勢；在貯藏后期，完整蝦組的硬度和彈性顯著低于去頭蝦組（P＜0.05）。該現象推測可能是由于在冷藏過程中，中華管鞭蝦肌肉蛋白氧化速度加快，肌肉細胞間結合力減小，從而使得蝦組織結構崩解[22]。在凍藏前期蝦肌肉硬度和彈性的上升，可能是由于細胞中自由水的流失，使得肌原纖維密度變大，從而導致蝦體肌肉硬度和彈性增大[23]。但隨著貯藏時間延長，肌原纖維蛋白被蛋白酶降解以及凍藏期間冰晶的出現破壞了膠原結構，因此二者的硬度和彈性又逐漸降低[24]。此外，Bahuaud等[25]研究表明，凍藏條件下質構特性與組織蛋白酶活性呈負相關關系，即肌肉中組織蛋白酶活性越高，硬度及彈性下降得越多。因此，在完整蝦組貯藏期間，可能發生了蝦頭內組織蛋白酶的遷移，引起完整蝦組肌肉中組織蛋白酶活性上升幅度大，加快了完整蝦組硬度和彈性劣變速率。

表1 冷藏和凍藏條件下中華管鞭蝦蝦肉質構特性變化情況Table 1 Changes of muscle texture characteristics of shrimps(Solenocera crassicornis) during cold storage and frozen storage

2.5 低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉水分含量變化情況

如圖4所示，隨著貯藏周期延長，蝦肌肉的水分含量呈不斷下降趨勢，且在貯藏后期，完整蝦組肌肉的水分含量顯著低于比去頭蝦組（P＜0.05）。貯藏第0 d時，完整蝦組和去頭蝦組肌肉的水分含量為77.35%和77.30%；經冷藏6 d后，其分別下降4.74%和3.89%；而經凍藏120 d后，二者分別下降12.62%和10.67%。在貯藏過程中，蝦肌肉的肌原纖維會被組織蛋白酶快速分解，導致其含量下降，細胞間空隙變大，加劇了水分流失[18]。此外，李玲等[26]發現肌肉中蛋白質的氧化降解，以及在貯藏過程中冰晶的形成均會對細胞膜產生破壞，使細胞中水分在滲透壓的作用下流出，最終導致其水分含量降低。在本研究中，完整蝦組肌肉水分含量一直低于去頭蝦組，可能是由于在完整蝦組貯藏期內，蝦頭中內源性蛋白酶存在某種遷移機制，使完整蝦組中內源酶活性高于去頭蝦組，加快了蛋白氧化和肌纖維的降解，導致蝦肌肉的水分含量快速下降。

圖4 冷藏（a）和凍藏（b）條件下中華管鞭蝦肌肉水分含量變化情況Fig.4 Changes of moisture content of red shrimp muscle during cold storage (a) and frozen storage (b)

2.6 低溫貯藏中華管鞭蝦肌肉不同亞細胞組分中組織蛋白酶H變化情況

組織蛋白酶H是一種內肽-氨肽酶，在貯藏過程中，其活性的上升會加快蝦體肌原纖維結構劣化速率，從而影響蝦肌肉品質[27-28]。如圖5b和圖6b所示，隨著貯藏周期延長，整蝦和去頭蝦組溶酶體中組織蛋白酶H活性呈不斷下降的趨勢，在冷藏6 d和凍藏120 d后分別下降14.04%、11.29%和56.96%、61.12%。這可能主要是由于蝦體死后，細胞內溶酶體膜失穩而發生破裂，導致溶酶體中組織蛋白酶被釋放出去，轉移到了其它細胞組織中[9]。而在凍藏過程中，冰晶的生成加速了組織的破裂，溶酶體中組織蛋白酶轉移速度加快，這導致其活性快速下降[12]。細胞線粒體中組織蛋白酶H活性變化情況，如圖5c和圖6c所示，在0～2 d冷藏過程中，二者下降幅度較小，2 d后開始快速下降；而在凍藏過程中出現先上升后下降的趨勢。該現象推測可能是由于溶酶體破裂后，其中的組織蛋白酶轉移到線粒體中，使得線粒體中酶活性稍微上升，隨著組織蛋白酶接觸并破壞線粒體結構，促使線粒體發生凋亡現象，最終導致整體酶活性呈下降趨勢[29-30]。在肌原纖維中組織蛋白酶H活性變化情況（圖5a和圖6a），與線粒體中變化趨勢大致相似。在貯藏初期，組織蛋白酶H活性呈上升趨勢，這可能也與溶酶體的分解有關。肌漿中組織蛋白酶H活性變化情況，如圖5d和圖6d所示，在冷藏過程中，完整蝦和去頭蝦組肌漿中組織蛋白酶H活性呈不斷下降趨勢；而在凍藏過程中，兩者酶活性呈先上升后下降再上升的趨勢，且在貯藏后期，去頭蝦組肌漿中組織蛋白酶活性顯著低于完整蝦組（P＜0.05），在冷藏6 d和凍藏120 d后兩者酶活性分別下降6.97%、14.00%和12.26%、22.43%。這可能主要是由于在貯藏前期，溶酶體的破裂使其中組織蛋白酶釋放到肌漿中；在20～80 d凍藏過程中，組織蛋白酶活性受低溫抑制逐漸減少；而在凍藏80 d后，酶活性逐漸上升，這可能是由于在凍藏80 d后低溫對酶活性的抑制能力降低，從而導致組織蛋白酶活性的上升，這與柳佳彤[31]的研究結論相似。在本研究中，完整蝦組肌肉的酶活性在貯藏前期明顯高于去頭蝦組，推測可能是由于在貯藏過程中，蝦頭內組織蛋白酶存在某種遷移機制，使得蝦頭部中的酶轉移到蝦肌肉中。

圖5 冷藏下中華管鞭蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性變化情況Fig.5 Changes of cathepsin H activity in subcellular components of red shrimp muscle during cold storage

圖6 凍藏下中華管鞭蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性變化情況Fig.6 Changes of cathepsin H activity in subcellular components of red shrimp muscle during frozen storage

2.7 SDS-PAGE凝膠電泳分析

SDS-PAGE能夠檢測蝦肌原纖維蛋白在不同貯藏方式下降解情況。研究表明，在貯藏過程中，部分蛋白質如肌球蛋白重鏈（MHC，～180 kDa）、副肌球蛋白（～110 kDa）、肌動蛋白（～45 kDa）、肌鈣蛋白T（～34 kDa）和肌球蛋白輕鏈（MLC，～17 kDa），變化相對明顯[32-33]。中華管鞭蝦完整蝦和去頭蝦肌原纖維蛋白的變化如圖7所示，在不同貯藏方法下蛋白質圖譜存在明顯差異。新鮮蝦（A）的蛋白條帶最清晰，冷藏6 d（B、C）、凍藏120 d（D、E）后，MHC、肌鈣蛋白和MLC等蛋白條帶強度下降，肌動蛋白無明顯變化。這是由于蝦肌肉中蛋白在貯藏過程中發生降解，從而影響其結構特性。而肌肉肌原纖維蛋白的水解被認為與肌肉質量和內源酶活性的變化有關，并已證明其會損害肌肉纖維結構，且與肌肉硬度和彈性的降低有關[34]。Bhat等[35]研究表明，在肌肉中，MHC被認為是最容易降解的蛋白質，而低于MHC的90和110 kDa蛋白帶的強度則被認為是肌球蛋白重鏈蛋白水解的指標。從圖中可以發現，副肌球蛋白等鹽溶性蛋白在貯藏一段時間后蛋白條帶強度明顯變弱，且完整蝦組蛋白條帶變化更為明顯。這可能是由于在低溫凍藏下，冰晶的形成使得肌肉組織中水分減少，使未被凍結的細胞液濃縮，從而使離子強度和pH發生很大的變化，有機溶劑和金屬鹽的濃度也相對增大，最終導致蛋白發生冷凍變性，其含量下降[22]。同時實驗表明，在不同的貯藏方法下，蝦肌肉中內源酶活性的升高加快了肌肉蛋白的降解速度，從而導致大多數蛋白條帶的強度降低。這些結果論證了上述關于肌原纖維蛋白含量、酶活性、質構等的研究結果。

3 結論

本文通過對中華管鞭蝦在不同貯藏方式下肌肉品質及不同亞細胞結構中蛋白酶活性的研究發現，隨著貯藏周期的延長，中華管鞭蝦肌肉的pH不斷升高，水分含量、持水力和肌原纖維蛋白含量不斷下降，其硬度和彈性均呈先上升后下降趨勢；在凍藏方式下，蝦肉劣化速度慢于冷藏，且蝦在去頭后，其部分蛋白降解速率低于完整蝦；同時在不同亞細胞組分中，完整蝦組肌肉酶活性在貯藏前期均明顯高于去頭蝦組。由此可以得出，低溫凍藏下去頭的方式更適合中華管鞭蝦的貯藏。