金磁微粒模擬酶電化學(xué)增強體系快速檢測尿酸的含量

關(guān)樺楠，吳巧艷，彭 勃，薛 悅，龔德壯，劉曉飛，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

尿酸（2,6,8-三羥基嘌呤，UA）是人體內(nèi)最重要的生物分子，為嘌呤和核苷酸代謝的終產(chǎn)物，在人體中發(fā)揮著重要的抗氧化作用，可以清除體內(nèi)的氧自由基，阻止人體走向衰老，并提高機體的免疫力[1]。由于其在水中的溶解度偏低（約6 mg/L），容易在人體和體液中積累形成固態(tài)尿酸，導(dǎo)致痛風(fēng)和腎結(jié)石等疾病[2]。高尿酸血癥是由尿酸分泌過多所致，尿酸分泌過多已被判定為痛風(fēng)的主要原由。且高尿酸血癥常伴有高血壓、糖尿病、腎病、肥胖、冠心病等疾病[3]。因此，準確分析和檢測UA水平是臨床診斷的必要條件。目前，常用于檢測UA的方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[4]、比色法[5]、熒光法[6]、毛細管電泳法[7]、酶傳感器法[8]以及磷鎢酸還原法[9]等。由于熒光法和色譜方法耗時，設(shè)備昂貴，易受干擾且不方便操作等缺點限制了這些方法在檢測尿酸方面的應(yīng)用。近年來，電化學(xué)方法因其靈敏度高、檢測范圍廣、檢測速度快、操作簡單和低消耗引起了廣泛關(guān)注[10-12]。因此，電化學(xué)方法已成為分析化學(xué)的重要組成部分，并已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

天然酶因其穩(wěn)定性差、制備成本高等缺陷使其應(yīng)用范圍逐漸縮小[13-15]，納米模擬酶在許多方面具有獨特的優(yōu)勢，如穩(wěn)定性好、成本低、易于長期儲存和催化活性強等[16-17]。納米Fe3O4粒子的尺寸小于某一臨界值時，會呈現(xiàn)出超順磁性、高矯頑力、高磁化率等特性[18-19]。同時，金納米粒子（AuNPs）也表現(xiàn)出高導(dǎo)電率，高穩(wěn)定性和優(yōu)良的生物相容性等優(yōu)點[20-21]，因而在生物傳感[22]、藥物傳輸[23]、醫(yī)學(xué)診斷[24]中得到了廣泛的應(yīng)用。通過靜電自組裝技術(shù)[25]所制備的磁性納米復(fù)合金磁微粒（Fe3O4@Au）分布均勻，吸附性強，比表面積大，可以良好的改善電催化性能，從而增強電化學(xué)傳感器的電化學(xué)響應(yīng)[26]。本研究采用自組裝法制備Fe3O4@Au，將其與電化學(xué)相結(jié)合，利用Fe3O4@Au過氧化物模擬酶活性，促進H2O2分解形成羥基自由基（·OH），催化UA在電極表面發(fā)生氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生大量電子轉(zhuǎn)移[27]，從而增加電極表面電子的轉(zhuǎn)移，增強電流響應(yīng)信號，建立檢測UA含量的新型電化學(xué)方法，以期對臨床診斷尿酸方法進行改進。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FeCl3·6H2O、APTES 國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；HAc-NaAc緩沖液、NaAc·3H2O、HAc-乙醇溶液、H2O2、尿酸、乙醇、PEG-4000、氯金酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；所有試驗中所用試劑均為分析純。

YZHR-25型水熱反應(yīng)釜 上海耀冠儀器有限公司；H-7500型透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；KQ 3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；VSM LDJ 9600型振動磁強計 北京翠海佳誠磁電科技有限責(zé)任公司；FC204型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司；CH1660E型電化學(xué)工作站

上海辰華儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原理 本研究中的所有反應(yīng)均利用三電極系統(tǒng)，在室溫下進行。使用CH1660E電化學(xué)工作站進行檢測，工作原理如圖1所示。當檢測體系中加入納米Fe3O4@Au時，F(xiàn)e3O4@Au能夠有效催化H2O2分解形成大量的氧化活性物質(zhì)（主要為·OH和HOO·）[28]，可進一步催化UA在電極附近發(fā)生氧化反應(yīng)，UA氧化為脫氧尿酸（Dehydrourate，UAD），產(chǎn)生的電子積聚在電極表面，增強電化學(xué)響應(yīng)，改善電化學(xué)檢測尿酸的靈敏度。

圖1 電化學(xué)檢測尿酸示意圖Fig.1 Schematic illustration of the electrochemical detection of uric acid

1.2.2 Fe3O4@Au微粒的制備 準備60 mL乙二醇，2.0 g的FeCl3·6H2O，1.2 g的PEG-4000，4.2 g的NaAc·3H2O，依次加入100 mL燒杯中，加入攪拌子，通過使用磁力攪拌器得到均勻的混合溶液，迅速轉(zhuǎn)移到水熱反應(yīng)釜中，在180 ℃條件下加熱反應(yīng)10 h后，室溫下自然冷卻，結(jié)果產(chǎn)物用無水乙醇和去離子水洗滌，重復(fù)三次。洗滌后干燥備用。

首先，燒杯中加入200 mL 80 ℃蒸餾水，精確稱量80 g新鮮葡萄皮，并將其浸入燒杯中20 min，將浸泡液離心（3000 r/min）并分離5 min。取上清液200 mL作為工作液體。然后將燒杯于4 ℃條件下提前預(yù)冷卻，分別取25 mL HAuCl4和6 mL工作液于燒杯中，通過使用恒溫磁力攪拌器低速混合來觀察溶液的顏色變化，當出現(xiàn)酒紅色時，迅速加快攪拌速度，30 min后，所得溶液于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取4 g上述制備的Fe3O4NPs顆粒，并將其加入到60 mL 乙醇溶液（20%）中，利用超聲使其在溶液中分散均勻，再緩慢加入2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搖勻，將此體系置于恒溫搖床中，調(diào)節(jié)振蕩速度為150 r/min，持續(xù)10 h后，觀察溶液顏色為淺棕色，即得到氨基化Fe3O4NPs磁性顆粒。將所得產(chǎn)物用0.1 mol/L HAc-乙醇溶液清洗，重復(fù)三次，清洗后放入60 ℃真空干燥箱，干燥備用。制備好的氨基化磁性納米顆粒Fe3O43 g加入到燒杯中，然后將金納米粒子溶液緩慢加入到燒杯中，在加入過程中不斷地攪拌，之后將燒杯置于攪拌器臺上，調(diào)節(jié)為低速狀態(tài)，攪拌12 h后，即可得到磁性納米顆粒Fe3O4@Au混懸液，烘干備用。

1.2.3 Fe3O4@Au微粒的表征 將制備的磁性材料粉末置于100 mL蒸餾水中，40 kHz 超聲振蕩使其均勻分散，然后將少量分散在蒸餾水中的樣品滴鑄在碳包覆的銅網(wǎng)格上制備。利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察材料的形態(tài)和粒徑，工作電壓為80 kV。

1.2.4 檢測條件的單因素實驗 反應(yīng)溫度對電化學(xué)體系的影響：配制pH為5.0的HAc-NaAc緩沖液10 mL，加入納米Fe3O4@Au顆粒0.96 mg/mL，再加入200 μL 50 mmol/L的H2O2標準液，采用電熱恒溫水浴鍋將該體系加熱至恒定溫度（20、30、40、50和60 ℃），反應(yīng)15 min后，再加入200 μL的尿酸標準溶液（1 mmol/L）。調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站掃描速率為0.06 V/s，考察反應(yīng)溫度對電化學(xué)體系的影響。

Fe3O4@Au添加量對電化學(xué)體系的影響：配制pH為5.0的HAc-NaAc緩沖液10 mL，加入納米Fe3O4@Au顆粒（0.24、0.48、0.72、0.96和1.20 mg/mL），再加入200 μL 50 mmol/L的H2O2標準液，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間15 min，再加入200 μL的尿酸標準溶液（1 mmol/L）。調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站掃描速率為0.06 V/s，考察Fe3O4@Au添加量對電化學(xué)體系的影響。

掃描速率對電化學(xué)體系的影響：配制pH為5.0的HAc-NaAc緩沖液10 mL，加入納米Fe3O4@Au顆粒0.96 mg/mL，再加入200 μL 50 mmol/L的H2O2標準液，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間15 min，再加入200 μL的尿酸標準溶液（1 mmol/L）。調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站掃描速率（0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 V/s），考察掃描速率對電化學(xué)體系的影響。

pH對電化學(xué)體系的影響：配制不同pH（pH=5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）HAc-NaAc緩沖液10 mL，加入納米Fe3O4@Au顆粒0.96 mg/mL，再加入200 μL 50 mmol/L的H2O2標準液，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時間15 min，再加入200 μL的尿酸標準溶液（1 mmol/L）。調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站掃描速率0.06 V/s，考察pH對電化學(xué)體系的影響。

1.2.5 正交設(shè)計優(yōu)化試驗 將一定濃度的納米Fe3O4@Au顆粒和200 μL 50 mmol/L的H2O2標準溶液加入到10 mL一定pH的HAc-NaAc緩沖液中，加熱反應(yīng)15 min后，加入濃度為1 mmol/L的尿酸標準溶液。采用三電極系統(tǒng)，調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站不同掃描速率，利用循環(huán)伏安法檢測體系中的尿酸濃度，考察氧化峰電流絕對值的變化，重復(fù)實驗3次，確定因素影響主次順序及優(yōu)選方案，詳情見表1。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 尿酸電化學(xué)檢測體系工作曲線的測定 在最適添加量、最適溫度、pH和掃描速率體系下，向小燒杯中準確量取10 mL HAc-NaAc緩沖液，加入200 μL 50 mmol/L的H2O2溶液，再加入一定質(zhì)量的金磁微粒納米顆粒，恒溫水浴15 min后，分別加入200 μL（0.1、0.25、0.50、1、2.5、5和10 mmol/L）尿酸標準溶液，連接好三電極系統(tǒng)，調(diào)節(jié)電化學(xué)工作站掃描速率，通過CV法檢測氧化峰電流絕對值，重復(fù)實驗3次。根據(jù)不同尿酸濃度與氧化峰電流絕對值繪制工作曲線。

1.2.7 檢出限及回收率的測定 根據(jù)不同尿酸濃度與氧化峰電流絕對值繪制工作曲線，根據(jù)方程計算最低檢測限。選擇不同濃度0.5、2.5和10 mmol/L的尿酸標準液，檢測其氧化峰電流絕對值，重復(fù)實驗6次，將結(jié)果代入工作曲線回歸方程，評價其回收率和精密度。

1.2.8 抗干擾性的測定 采用正交優(yōu)化設(shè)計獲得的優(yōu)選方案，分別加入K2SO4、NaCl、CuCl2、AlCl3、蔗糖和甘氨酸等食品中常見物質(zhì)，濃度均為0.1 mol/L，通過考察反應(yīng)過程中氧化峰電流絕對值的變化，對其抗干擾性能進行監(jiān)測。

1.2.9 實際樣品檢測 為驗證本研究所構(gòu)建的新型電化學(xué)檢測方法在實際樣品中的可實用性，選擇正規(guī)超市購買的純牛奶作為樣品，將其與1.12%偏磷酸溶液（1:1）混合，以沉淀乳蛋白。并于2000 r/min離心15 min后，提取上清液，以1:1的比例加入氯仿（95%），以溶解乳脂。渦旋1 min后，以2000 r/min離心20 min，取其上清液，加入尿酸標準液，得到牛奶工作溶液。按照優(yōu)選方案檢測體系，檢測3種不同濃度牛奶樣品溶液的氧化峰電流絕對值，重復(fù)實驗3次，計算加標回收率并評價該檢測體系的精確度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金磁微粒的表征

利用透射電子掃描電鏡（TEM）對所制備的磁性納米Fe3O4@Au結(jié)構(gòu)和形貌進行表征，結(jié)果如圖2所示。由圖2a可以看出，F(xiàn)e3O4納米粒子結(jié)構(gòu)多為球形，且聚集在一起，粒徑較小，約為130 nm。由圖2b可以看出，所制備的金納米粒子結(jié)構(gòu)為圓球形，且大小較為一致，分散度良好，平均粒徑約為7～9 nm。由圖2c可以看出，F(xiàn)e3O4納米粒子表面積聚了大量的金納米粒子，表明經(jīng)氨基化的磁性Fe3O4可以大量覆載金納米粒子，該方法已成功制備出磁性納米復(fù)合材料Fe3O4@Au。

圖2 （a）Fe3O4、（b）金納米粒子和（c）Fe3O4@Au TEM圖像Fig.2 TEM images of (a) Fe3O4 (b) AuNPs and(c) Fe3O4@Au clusters

2.2 電化學(xué)檢測尿酸單因素試驗

2.2.1 反應(yīng)溫度對電化學(xué)體系的影響 反應(yīng)溫度對電化學(xué)檢測體系有直接影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，氧化峰電流絕對值隨反應(yīng)溫度不斷上升而逐漸增大，當溫度在20～30 ℃區(qū)間內(nèi)時，反應(yīng)速率迅速增加，電極表面的電荷數(shù)量增加，電子轉(zhuǎn)移速度加快，電流響應(yīng)信號增強，氧化峰電流絕對值快速升高；當溫度在30～60 ℃區(qū)間內(nèi)時，隨溫度的不斷升高，檢測體系中Fe3O4@Au模擬酶活性增強，H2O2不斷被氧化分解產(chǎn)生大量氧化活性自由基，從而加快了尿酸的電催化氧化，電極表面的電子轉(zhuǎn)移數(shù)目不斷增多，增強了電化學(xué)響應(yīng)信號，氧化峰電流絕對值隨之變大，考慮到該電化學(xué)傳感系統(tǒng)的實用性，反應(yīng)溫度過高不利于其即時檢測。因此，在進行正交優(yōu)化試驗設(shè)計中，選擇反應(yīng)溫度為40、50和60 ℃。

圖3 反應(yīng)溫度對電化學(xué)檢測體系的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the electrochemical detection system

2.2.2 Fe3O4@Au添加量對電化學(xué)體系的影響 由圖4可知，氧化峰電流絕對值隨檢測體系中Fe3O4@Au添加量的不斷增加而穩(wěn)定升高，當Fe3O4@Au添加量在0.24～0.48 mg/mL區(qū)間內(nèi)時，反應(yīng)速率開始變大，氧化峰電流絕對值隨之增加；當Fe3O4@Au添加量在0.48～0.96 mg/mL區(qū)間內(nèi)時，反應(yīng)速率繼續(xù)變大，氧化峰電流絕對值持續(xù)增加，說明隨著電化學(xué)檢測體系中Fe3O4@Au添加量的增加，增強了檢測體系中模擬酶催化活性，促進H2O2氧化分解產(chǎn)生更多的羥基自由基；當Fe3O4@Au添加量在0.96～1.20 mg/mL區(qū)間內(nèi)時，氧化峰電流絕對值的上升趨勢變得緩慢，反應(yīng)速率隨之減小，說明隨著納米Fe3O4@Au在電化學(xué)檢測體系中不斷添加，產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，比表面積減小，導(dǎo)致其模擬酶活性降低，體系中電子轉(zhuǎn)移量隨之減少。因此，在進行正交優(yōu)化試驗設(shè)計中，選擇Fe3O4@Au添加量為0.72、0.96和1.20 mg/mL。

圖4 Fe3O4@Au添加量對電化學(xué)檢測體系的影響Fig.4 Effect of Fe3O4@Au addition on the electrochemical detection system

2.2.3 掃描速率對電化學(xué)體系的影響 掃描速率對電化學(xué)檢測體系的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，尿酸檢測過程中氧化峰電流絕對值隨掃描速率v的增大而增大，由氧化峰電流值與掃描速率平方根的線性曲線關(guān)系可知，氧化峰電流值|ipa（μA）|與掃描速率平方根在0.02～0.10 V/s范圍內(nèi)時表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，回歸方程為：|ipa（μA）|=15.3821/2（V/s）1/2+1.773（R2=0.9932），表明尿酸在玻碳電極表面發(fā)生的氧化反應(yīng)過程受表面吸附控制，可以更好地增強電化學(xué)響應(yīng)信號[29]。由于掃描速率過大會影響尿酸電化學(xué)檢測體系的穩(wěn)定性，因此，在進行正交優(yōu)化試驗設(shè)計中，選擇電化學(xué)檢測體系的掃描速率為0.06、0.08和0.10 V/s。

圖5 掃描速率平方根與峰值電流的關(guān)系Fig.5 Peak current vs. square root of scan rate

2.2.4 pH對電化學(xué)體系的影響 緩沖液的pH對電化學(xué)檢測體系的影響結(jié)果如圖6所示。氧化峰電流絕對值隨緩沖液pH的增大先升高后減小，當緩沖液pH在5.0～5.5區(qū)間內(nèi)時，氧化峰電流值變大，且到達最高點，說明此時納米Fe3O4@Au模擬酶催化效果最顯著，當pH在5.5～6.0范圍內(nèi)時，氧化峰電流絕對值大幅度減小，而pH在6.0～7.0范圍內(nèi)時，氧化峰電流絕對值持續(xù)減小，說明緩沖液的pH對尿酸檢測體系的電子轉(zhuǎn)移有明顯的影響，首先，pH=5.5時，納米Fe3O4@Au的電催化性能被激發(fā)到最大；其次，尿酸的氧化反應(yīng)過程有質(zhì)子的參與[30]，質(zhì)子覆蓋了從尿酸中產(chǎn)生的電子，抑制了電極表面電子的轉(zhuǎn)移，電流強度值明顯下降。因此，在進行正交優(yōu)化試驗設(shè)計中，選擇緩沖液pH為5.0、5.5和6.0。

圖6 pH對電化學(xué)增強檢測體系的影響Fig.6 Effect of pH on the electrochemical detection system

2.3 正交設(shè)計優(yōu)化電化學(xué)檢測尿酸體系

結(jié)果如表2所示，實驗中各因素對尿酸檢測體系的主次順序為：C＞A＞B＞D，即掃描速率＞溫度＞Fe3O4@Au添加量＞pH。通過極差分析確定的最優(yōu)方案組合為：A3B3C3D2，即溫度為60 ℃，金磁微粒添加量為1.20 mg/mL，掃描速率為0.1 V/s，緩沖溶液pH=5.5。因此，說明掃描速率是影響Fe3O4@Au模擬酶催化體系的最主要因素，溫度、醋酸緩沖溶液pH及Fe3O4@Au添加量對模擬酶檢測尿酸濃度也有相應(yīng)的影響。以最優(yōu)方案對1 mmol/L尿酸進行3次獨立平行試驗，得到氧化峰電流絕對值平均值約為14.56 μA，相對標準偏差（RSD）為1.45%，表明該尿酸傳感器檢測體系精密度良好。

表2 正交試驗結(jié)果分析Table 2 Result of orthogonal experiment

2.4 尿酸檢測體系的電化學(xué)響應(yīng)效果

2.4.1 模擬酶電化學(xué)檢測體系的工作曲線、最低檢出限和回收率測定 如圖7A所示，在0.1～10 mmol/L范圍內(nèi)，氧化峰電流絕對值隨尿酸濃度的增加而增大。采用循環(huán)伏安法考察不同濃度的尿酸標準溶液與氧化峰電流絕對值的線性效果，結(jié)果如圖7B所示，尿酸在0.1～10 mmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=13.267x+6.044，R2=0.9952。根據(jù)方程計算最低檢出限為0.087 μmol/L（3s/b）。分別檢測0.5、2.5和10 mmol/L的尿酸標準液，根據(jù)工作曲線回歸方程，對該電化學(xué)檢測體系進行回收率評價，回收率分別為105.30%、104.15%和96.17%，說明基于Fe3O4@Au模擬酶電化學(xué)檢測尿酸的方法具有良好的準確度。

圖7 不同濃度下尿酸循環(huán)伏安響應(yīng)及相應(yīng)的校準曲線Fig.7 Electrochemical response to UA with different concentrations and their linear calibration plot

2.4.2 電化學(xué)檢測體系抗干擾性能 根據(jù)所構(gòu)建的尿酸檢測電化學(xué)傳感器，考察氧化峰電流絕對值的變化，評估該檢測方法的抗干擾性能。向檢測體系中分別添加濃度為0.1 mol/L的K2SO4、NaCl、CuCl2、AlCl3、蔗糖和甘氨酸這些食品中常見干擾物質(zhì)（每種添加物的濃度均為尿酸濃度的100倍）獲得氧化峰電流絕對值，以1 mmol/L尿酸的體系作為參照，從而評估其抗干擾性能，結(jié)果如圖8所示，電化學(xué)催化檢測體系中加入0.1 mol/L的K2SO4、NaCl、CuCl2、AlCl3、蔗糖和甘氨酸均沒有較強的電化學(xué)響應(yīng)，而尿酸標準液具有明顯的電化學(xué)響應(yīng)信號。綜上所述，該電化學(xué)檢測方法對尿酸有較高的選擇性。

圖8 尿酸檢測體系的選擇性Fig.8 Selectivity investigation of the proposed sensor for detection of UA

2.5 實際樣品檢測

在相同體系下檢測含有0.042、0.42和0.84 g/L濃度UA的牛奶標準溶液的氧化峰電流絕對值，帶入工作曲線回歸方程，評價其加標回收率。結(jié)果如表3所示，該電化學(xué)檢測體系加標回收率分別為110.2%、97.9%和101.2%。重復(fù)測定3次，RSD分別為0.73%、1.84%和3.42%，均小于4%，說明該電化學(xué)檢測體系具有良好的加標回收率和精密度，可實現(xiàn)對實際樣品中UA的檢測。

表3 檢測實際樣品中不同濃度尿酸的加標回收率和精密度Table 3 Recovery rate and precision of real sample on different concentrations of uric acid

3 結(jié)論

基于Fe3O4@Au納米復(fù)合材料催化H2O2體系，構(gòu)建了一種快速、靈敏、低成本的尿酸電化學(xué)傳感器。該方法在UA濃度為0.1～10 mmol/L時具有明顯的線性動態(tài)范圍，檢出限低至0.087 μmol/L，該電化學(xué)檢測體系加標回收率分別為110.2%、97.9%和101.2%。該類傳感器在潛在干擾物質(zhì)存在下具有較高的選擇性，并且成功應(yīng)用于牛奶樣品中的尿酸檢測。本研究將為實際樣品中尿酸的檢測提供基礎(chǔ)資料。