響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶酶解制備可口革囊星蟲膠原蛋白抗氧化肽工藝研究

彭易鑫，陸旭麗 ，代亞萍，曹玉坡，李積華，龔 霄，龐 杰

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524001；3.海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524001）

可口革囊星蟲（Phascolosoma esculenta）屬星蟲動(dòng)物門，革囊星蟲綱，革囊星蟲目，革囊星蟲科，俗稱海泥丁、土筍等，是棲息于淺海沙、泥沙底質(zhì)等環(huán)境中的一種海洋環(huán)節(jié)動(dòng)物，廣泛分布于我國(guó)福建、廣東、廣西等地[1]。可口革囊星蟲具有廣泛的藥用價(jià)值，有滋陰、補(bǔ)腎、去火的食療作用，被譽(yù)為“動(dòng)物人參”、“海中的冬蟲夏草”[2]。可口革囊星蟲富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多糖、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為典型高蛋白低脂肪海產(chǎn)品[3]。膠原蛋白（collagen）又稱膠原，是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質(zhì),常以纖維形式存在于動(dòng)物體組織中，是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)[4]。膠原蛋白酶解后，得到分子量在2000 Da以下的多肽，容易被人體吸收，沒有過敏反應(yīng)，還可促進(jìn)食品中其它蛋白質(zhì)的吸收，是一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的多肽[5]。研究表明，低分子活性膠原蛋白及多肽具有促進(jìn)傷口愈合[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、降血壓[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等多種活性。目前，膠原肽已成為繼膠原蛋白后生物醫(yī)藥、食品等的熱門原料之一。

國(guó)內(nèi)外近幾年在開發(fā)水產(chǎn)膠原蛋白抗氧化活性肽方面做了大量的研究。秦倩倩等[11]從草魚皮中提取膠原蛋白并通過酶解法制備得到具有抗氧化功效的多肽；李露園等[12]通過酶法制備鱘魚皮膠原蛋白多肽并發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化作用；Wu等[13]以鮭魚皮為原料酶解制備膠原蛋白肽，研究表明該多肽具有良好的抗氧化功效。然而，目前水產(chǎn)膠原蛋白抗氧化肽的制備多以魚皮、魚肉等為原料，這大大限制了水產(chǎn)膠原蛋白抗氧化肽的生產(chǎn)與開發(fā)。此外，水產(chǎn)膠原蛋白抗氧化肽的制備方法多采用單酶酶解。研究表明，蛋白的酶解程度與抗氧化活性肽段生成的數(shù)量直接相關(guān)，且酶解過程中酶種類的選擇以及酶解工藝參數(shù)對(duì)多肽抗氧化活性的高、低起著決定性作用[14]。另外，采用兩種或以上蛋白酶復(fù)合酶解可以得到比單酶酶解更好的酶解效果，如堿性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶等的復(fù)配使用不僅能增加蛋白質(zhì)利用率，且能在一定程度上提高水解度[15]。

因此，本研究以可口革囊星蟲為原料，從中提取膠原蛋白，然后以總抗氧化能力和超氧陰離子清除率為考察指標(biāo)，通過蛋白酶的篩選及復(fù)合酶組合試驗(yàn)確定最佳酶解方案，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶酶解制備可口革囊星蟲膠原蛋白抗氧化肽的酶解工藝，得到抗氧化活性較強(qiáng)的膠原蛋白肽，以期為可口革囊星蟲膠原蛋白抗氧化肽的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。課題的研究可以為膠原蛋白抗氧化肽的來源提供新的途徑，對(duì)可口革囊星蟲的開發(fā)利用具有重要價(jià)值，對(duì)水產(chǎn)及水產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

可口革囊星蟲 湛江農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；酸性蛋白酶（50000 U/g）、中性蛋白酶（60000 U/g）、堿性蛋白酶（200000 U/g）、胃蛋白酶（250000 U/g）、胰蛋白酶（250000 U/g）、木瓜蛋白酶（800000 U/g）、羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒、超氧陰離子清除能力檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；透析袋 湛江科銘科技有限公司；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

U-T6系列紫外可見分光光度計(jì) 屹譜儀器制造（上海）有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；低溫離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；真空冷凍干燥機(jī) 上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可口革囊星蟲膠原蛋白肽的制備工藝流程可口革囊星蟲→預(yù)處理→絞碎勻漿→酸溶→鹽析→超聲、振蕩→離心→透析→冷凍干燥→酶解→滅酶→冷卻→凍干→膠原蛋白肽[16]。

操作要點(diǎn)：稱取1 kg可口革囊星蟲成蟲，清除內(nèi)臟，清洗并剪碎后，加入10%的正丁醇溶液萃取一天，除去脂肪，再加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡48 h，除去雜蛋白，用紗布過濾，蒸餾水清洗至中性，攪碎勻漿，勻漿轉(zhuǎn)速1500 r/min，5～10次，每次10～20 s，漿液倒入0.5 mol/L冰醋酸中超聲20 min，然后于搖床中振蕩20 min，于4 ℃冰箱放置48 h后，用紗布過濾，向?yàn)V液中加入3 mol/L NaCl溶液鹽析，待膠原以白色絮狀沉淀析出后，4 ℃，10000 r/min離心20 min，取沉淀，棄去上清液，將沉淀復(fù)溶于0.5 mol/L冰醋酸，再次4 ℃，10000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液進(jìn)行透析，先用0.1 mol/L冰醋酸透析2 d，每4 h換一次透析液，再用蒸餾水透析，每4 h換一次蒸餾水，直至濾液中無氯離子（硝酸銀檢驗(yàn)無白色沉淀）且透析液為中性時(shí)，停止透析，凍干，得到可口革囊星蟲膠原蛋白，于-20 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用。稱取可口革囊星蟲膠原蛋白5 g，加入150 mL磷酸鹽緩沖液（pH7.5，0.02 mol/L），調(diào)節(jié)恒溫加熱磁力攪拌器至所需溫度，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)緩沖液pH至所需酶解pH，加酶進(jìn)行酶解，酶解達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，于沸水中煮沸5 min滅酶，終止反應(yīng)，快速冷卻至室溫，用離心機(jī)于4 ℃以10000 r/min離心15 min，收集上清，凍干即得到膠原蛋白肽。

1.2.2 蛋白酶的篩選 分別以胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶為水解用酶，于最適反應(yīng)條件下酶解可口革囊星蟲膠原蛋白（見表1），以總抗氧化能力和超氧陰離子清除率為考察指標(biāo)，選擇四種優(yōu)勢(shì)蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

老張，你是葫蘆套人。老冬瓜說，老鱖魚要?dú)⑷耍阏f說他要?dú)⒄l？在你們村，以前，村長(zhǎng)睡過他老婆，這事兒他是咋解決的？是像傳說的那樣，村長(zhǎng)請(qǐng)他吃了一頓飯，事兒就全部了結(jié)啦。你說說細(xì)節(jié)吧，大伙兒想聽哩。

表1 不同蛋白酶酶解試驗(yàn)條件Table 1 Experimental conditions of enzymatic hydrolysis with different proteases

1.2.3 酶解方案設(shè)計(jì) 選擇酶解效果較好的四種蛋白酶，分別進(jìn)行單酶酶解和復(fù)合酶解，酶解方案及酶解條件見表2，以酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力和超氧陰離子清除率為指標(biāo)，確定最佳酶解方案[17-18]。

表2 不同酶解方案的試驗(yàn)條件Table 2 Test conditions for different enzymatic hydrolysis schemes

1.2.4 酶解單因素實(shí)驗(yàn) 固定料液比1:30 g/mL，復(fù)合酶添加量6000 U/g，復(fù)合酶比例1:1（酶活力），酶解溫度50 ℃，酶解pH6.5，酶解時(shí)間4 h，以料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）、復(fù)合酶添加量（2000、4000、6000、8000、10000 U/g）、復(fù)合酶比例（1:2、1:1.5、1:1、1.5:1、2:1）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）為因素，改變其中一個(gè)因素，保持其他因素不變，考察這些因素對(duì)可口革囊星蟲膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響[19-20]。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間為影響因素，以總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的總評(píng)歸一值（OD）為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)[21-22]。試驗(yàn)因素及水平見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 3 Response surface test factor level table

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 總抗氧化能力測(cè)定 將試劑盒中的試劑一、試劑二、試劑三按7:1:1的比例混合，預(yù)溫到37 ℃，吸取900 μL混合液于1.5 mL離心管中，蛋白水解液經(jīng)滅酶離心后，吸取30 μL樣品液于離心管中，加入90 μL雙蒸水，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，充分混勻，反應(yīng)10 min，測(cè)定593 nm下的吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得Fe2+終濃度x（μmol/mL），結(jié)果按下式計(jì)算：

式中：x表示Fe2+終濃度，μmol/mL；V反總表示反應(yīng)總體積，1.02 mL；V樣表示反應(yīng)樣本體積，0.03 mL。

1.2.6.2 超氧陰離子清除率測(cè)定 取3個(gè)1.5 mL的離心管，分別作為空白管、對(duì)照管和測(cè)定管，同時(shí)加入40 μL試劑一，空白管加入200 μL蒸餾水，對(duì)照管加入160 μL試劑二和100 μL蒸餾水，測(cè)定管加入160 μL試劑二，充分混勻，25 ℃反應(yīng)1 min，然后空白管和對(duì)照管加入200 μL試劑三，測(cè)定管加入100 μL樣品溶液和200 μL試劑三，充分混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，向空白管、對(duì)照管和測(cè)定管同時(shí)加入200 μL試劑四和200 μL試劑五，充分混勻，37 ℃顯色20 min，空白管調(diào)零，在530 nm處測(cè)定對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值，結(jié)果按下式計(jì)算：

式中：A對(duì)照表示對(duì)照管吸光值；A測(cè)定表示測(cè)定管吸光值。

式中：d表示單指標(biāo)評(píng)價(jià)值；d1表示總抗氧化能力指標(biāo)評(píng)價(jià)值；d2表示超氧陰離子清除率指標(biāo)評(píng)價(jià)值；Yi表示指標(biāo)中第i個(gè)值；Ymin表示指標(biāo)中最小值；Ymax表示指標(biāo)中最大值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，采用Design-Expert V8.0軟件、Excel 2016和OriginPro 9.1軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選試驗(yàn)結(jié)果

如圖1，木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物總抗氧化能力和超氧陰離子清除率效果最好，中性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶其次，胰蛋白酶和堿性蛋白酶較差，這可能是由于木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶能有效作用于膠原蛋白表面結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確地進(jìn)行酶解反應(yīng)，因而水解作用較強(qiáng)，而胰蛋白酶和堿性蛋白酶相對(duì)較弱[25]。因此本試驗(yàn)選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶確定復(fù)合酶解方案。

圖1 不同蛋白酶酶解試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Experimental results of enzymatic hydrolysis with different proteases

2.2 酶解方案試驗(yàn)結(jié)果

如圖2，雙酶復(fù)合酶解（方案G5、G6、G7、G8、G9、G10）得到的多肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率均明顯高于單酶酶解（方案G1、G2、G3、G4），且木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解（方案G5）得到的多肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率均最高，分別為（1.253±0.013）μmol/mL和70.47%±1.05%。由于蛋白酶具有專一性，單酶只能水解幾個(gè)固定的氨基酸殘基，水解程度受到限制，復(fù)合酶切斷肽鍵的位置不同，能進(jìn)一步降低產(chǎn)物的分子量，得到分子量合理分布的水解液[26]。因此，本試驗(yàn)選擇木瓜蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解方案，制備可口革囊星蟲膠原蛋白抗氧化肽。

圖2 不同酶解方案的試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of different enzymatic hydrolysis schemes

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 液料比對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響 如圖3，增加提取液用量，膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子均呈先增大后減小的趨勢(shì)，在料液比1:30 g/mL時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大值（1.272±0.027）μmol/mL，超氧陰離子清除率達(dá)到最高70.08%±1.09%。這可能是由于提取液用量較低時(shí)，物料的粘稠度影響底物與酶的接觸，酶解效率較低，隨著提取液用量的增多，酶與底物更多的接觸，酶解反應(yīng)加快，但當(dāng)提取液用量太多時(shí)，底物濃度過低導(dǎo)致酶解效率降低[27]。綜合膠原肽測(cè)定結(jié)果，確定料液比為1:30 g/mL。

圖3 料液比對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.2 復(fù)合酶添加量對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響 如圖4，增加復(fù)合酶添加量，膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率均呈先增大后緩慢減小的趨勢(shì)，當(dāng)復(fù)合酶添加量為8000 U/g時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大值（1.276±0.019）μmol/mL，超氧陰離子清除率達(dá)到最高67.80%±0.76%。酶促反應(yīng)一般隨酶量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)酶量增加至飽和狀態(tài)時(shí)，酶解效果會(huì)趨于穩(wěn)定，但復(fù)合酶之間因可能存在相互影響而抑制酶活力，進(jìn)而影響游離氨基態(tài)氮的生成[28]。綜合膠原肽測(cè)定結(jié)果，確定復(fù)合酶添加量為8000 U/g。

圖4 復(fù)合酶添加量對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響Fig.4 Effects of compound enzyme addition amount on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.3 復(fù)合酶比例對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響 如圖5，隨著木瓜蛋白酶比例增加，膠原肽總抗氧化能力呈先增大后減小的趨勢(shì)，超氧陰離子清除率呈先減小后增大再減小的趨勢(shì)，當(dāng)復(fù)合酶比例為1:1時(shí)，總抗氧化能力最大為（1.283±0.014）μmol/mL，復(fù)合酶比例為1.5:1時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)到最高67.53%±0.59%。這可能是由于酶解過程中兩種酶分子均達(dá)到酶解反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)，某一種酶占比過高則會(huì)打破這種穩(wěn)態(tài)的體系[29]。綜合膠原肽測(cè)定結(jié)果，確定復(fù)合酶比例為1:1。

圖5 復(fù)合酶比例對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響Fig.5 Effects of complex enzyme ratio on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.4 酶解溫度對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響 如圖6，升高酶解溫度，膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大值（1.245±0.007）μmol/mL，酶解溫度為55 ℃時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)到最高67.61%±0.94%。這是由于在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高會(huì)增強(qiáng)酶活性，但過高溫度會(huì)讓酶活性降低甚至失活，導(dǎo)致酶解作用減弱[30]。綜合膠原肽測(cè)定結(jié)果，確定酶解溫度為50 ℃。

圖6 酶解溫度對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.5 酶解pH對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響 如圖7，隨著pH的增大，膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)pH為6.0時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)到最高69.06%±0.51%，當(dāng)pH為6.5時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大值（1.249±0.015）μmol/mL。說明只有在最適的pH范圍內(nèi)，酶與底物才會(huì)充分結(jié)合，pH偏高或偏低都會(huì)抑制酶活性,甚至使酶失活[31]。綜合膠原肽測(cè)定結(jié)果，確定酶解pH為6.5。

圖7 酶解pH對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響Fig.7 Effects of enzyme solution pH on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.6 酶解時(shí)間對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響 如圖8，延長(zhǎng)酶解時(shí)間，膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率均呈先增大后減小的趨勢(shì)，酶解時(shí)間為3 h時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)到最高68.98%±1.18%，酶解時(shí)間為4 h時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大值（1.281±0.008）μmol/mL。這是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間范圍內(nèi)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，酶解反應(yīng)逐漸徹底，超出此范圍后反而會(huì)抑制酶活性的發(fā)揮[32]。綜合膠原肽測(cè)定結(jié)果，確定酶解時(shí)間為4 h。

圖8 酶解時(shí)間對(duì)膠原肽總抗氧化能力和超氧陰離子清除率的影響Fig.8 Effects of enzymatic hydrolysis time on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，通過響應(yīng)面對(duì)總評(píng)歸一值（OD）與復(fù)合酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、酶解時(shí)間（D）進(jìn)行數(shù)學(xué)關(guān)系表達(dá)，得到擬合回歸方程模型：OD=0.95+0.17A+0.076B-0.050C+0.084D-3.500×10-3AB+1.250×10-3AC+0.051AD-0.026BC+2.500×10-4BD-2.500×10-4CD-0.20A2-0.24B2-0.24C2-0.20D2。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface test

回歸方程模型的顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果見表5，該模型F值為56.34，P值小于0.0001，為差異極顯著，說明方程模型擬合極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.0658（P＞0.05），為差異不顯著，則回歸方程模型有顯著意義[33]。模型可信度和準(zhǔn)確性的檢驗(yàn)指標(biāo)為決定系數(shù)（R2）和調(diào)整決定系數(shù)（R2Adj），兩個(gè)數(shù)值相差越小且越接近1，則證明模型試驗(yàn)數(shù)據(jù)越有效[34]。本試驗(yàn)中，決定系數(shù)R2為0.9049，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.9651，說明回歸方程模型適合膠原肽制備工藝的分析與預(yù)測(cè)。該回歸方程的一次項(xiàng)A、B、C、D和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)AD差異顯著（P＜0.05）。對(duì)比各因素的F值大小可知，對(duì)可口革囊星蟲膠原肽抗氧化活性的影響順序?yàn)椋簭?fù)合酶添加量（A）＞酶解時(shí)間（D）＞酶解溫度（B）＞酶解pH（C）。

表5 回歸方程模型的顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

圖9 ～圖14，隨著各因素水平的升高，抗氧化活性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。圖9～圖14顯示，沿A因素軸方向的響應(yīng)面坡度明顯比較陡峭，說明復(fù)合酶添加量相對(duì)酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間影響較大；圖12顯示，沿B因素軸方向的響應(yīng)面坡度較陡峭，說明酶解溫度對(duì)膠原肽抗氧化活性的影響較酶解pH大；圖13～圖14顯示，沿D因素軸方向的響應(yīng)面坡度較陡峭，說明酶解時(shí)間相對(duì)酶解溫度、酶解pH影響較大。響應(yīng)面水平方向的投影為等高線，交互作用顯著時(shí)，等高線為橢圓，交互作用不顯著時(shí)，等高線為圓形[35]。上述6組等高線圖顯示，復(fù)合酶添加量與酶解時(shí)間的等高線圖為橢圓形，交互作用最強(qiáng)；其次是酶解溫度與酶解pH；復(fù)合酶添加量與酶解溫度、復(fù)合酶添加量與酶解pH、酶解溫度與酶解時(shí)間、酶解pH與酶解時(shí)間的等高線圖為圓形，交互作用較弱。

圖9 復(fù)合酶添加量與酶解溫度交互作用對(duì)膠原肽抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of compound enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis temperature on antioxidant activity of collagen peptide

圖12 酶解溫度與酶解pH交互作用對(duì)膠原肽抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.12 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH on antioxidant activity of collagen peptide

圖13 酶解溫度與酶解時(shí)間交互作用對(duì)膠原肽抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.13 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity of collagen peptide

圖14 酶解pH與酶解時(shí)間交互作用對(duì)膠原肽抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.14 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity of collagen peptide

圖10 復(fù)合酶添加量與酶解pH交互作用對(duì)膠原肽抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of compound enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis pH on antioxidant activity of collagen peptide

圖11 復(fù)合酶添加量與酶解時(shí)間交互作用對(duì)膠原肽抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of compound enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity of collagen peptide

2.4.2 確定最佳酶解工藝參數(shù) 通過響應(yīng)面回歸方程模擬優(yōu)化，得到最佳酶解條件：復(fù)合酶添加量8135.25 U/g、酶解溫度51.58 ℃、酶解pH6.39、酶解時(shí)間4.17 h，預(yù)測(cè)OD值為0.989。參考實(shí)際操作，修正酶解條件為復(fù)合酶添加量8135 U/g、酶解溫度51.6 ℃、酶解pH6.4、酶解時(shí)間4.2 h，在此條件下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得膠原肽的總抗氧化能力為（1.333±0.021）μmol/mL，超氧陰離子清除率為78.75%±0.94%，OD值為0.986，與響應(yīng)面回歸模型所得到的預(yù)測(cè)值（0.989）非常接近，說明這次響應(yīng)面分析的回歸模型可以很好地預(yù)測(cè)實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果[36]，說明通過響

應(yīng)面優(yōu)化得到的復(fù)合酶酶解制備可口革囊星蟲膠原蛋白抗氧化肽的工藝條件確實(shí)可行，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法得到復(fù)合酶酶解制備可口革囊星蟲膠原抗氧化肽的最優(yōu)工藝條件為復(fù)合酶添加量8135 U/g、酶解溫度51.6 ℃、酶解pH6.4、酶解時(shí)間4.2 h，該條件下測(cè)得膠原肽的總抗氧化能力為（1.333±0.021） μmol/mL，超氧陰離子清除率為78.75%±0.94%，OD值為0.986，相比優(yōu)化前的膠原肽抗氧化活性（總抗氧化能力為（1.253±0.013） μmol/mL，超氧陰離子清除率為70.47%±1.05%）有明顯的增強(qiáng)效果，因此，通過響應(yīng)面優(yōu)化后的酶解工藝條件，能夠制備抗氧化活性更強(qiáng)的膠原蛋白肽。