酶解-發酵法制備魚鮮汁的工藝優化

徐劉貝，馬佳雯，蔡金秀，楊 華，戚向陽，曹少謙

（浙江萬里學院生物與環境學院，浙江寧波 315100）

為實現低值海魚的高值化利用，調味品的制備，是一種提高附加值的重要手段。海鮮調味料多以魚類、蝦蟹類、貝類等海產品為原料經過酶解或微生物發酵制備成高品質的復合調料味，如魚露、蠔油、蝦油、蟹醬等。海產品動物性蛋白含量豐富，蛋白質分解后產生谷氨酸鈉、琥珀酸鈉及鳥苷酸鈉等鮮味物質[1]，制作出來的調味品味道鮮美，營養豐富，風味獨特。另外，海產品中含有的牛磺酸、活性肽、鈣、碘等多種礦物質賦予了海鮮調味品特殊的保健功能，如具有降血壓[2]、抗氧化[3]等功能特性。然而傳統自然發酵產品質量不穩定，生產效率低，同時，高鹽濃度不利于人體健康[4]；而快速發酵可控制發酵條件，可以縮短發酵時間并降低鹽含量，提高生產效率，但該工藝下產品的色澤和風味通常遜色于傳統工藝釀造[5-6]。目前利用低值海魚及其下腳料制備海鮮調味品的研究主要集中在復合酶酶解[7]、微生物發酵[8]等方面，并以低鹽、速釀、改善風味為主要目的，從而實現低值海魚的高值化利用。

鮐魚（Pneumatophorus japonicus）屬于鱸形目，鯖科，鮐屬，又名青占魚、鮐鲅魚、鯖魚等，是我國目前近海主要捕撈的經濟魚種之一[9]。鮐魚具有很高的營養價值，每100 g鮐魚肉中，含蛋白21.4 g、脂肪7.4 g、鈣20 mg、磷226 mg、煙酸9.7 mg等[10]。鮐魚的加工利用有鮮食和加工成各種鮐魚罐頭，如紅燜鮐魚罐頭、五香鮐魚罐頭等，同時魚肝油的提取也是鮐魚深加工的一種[11]。鮐魚體內的自源酶活強，極易腐壞變質，因此捕撈后應立刻用冰塊進行凍藏[12]。近年來，對于鮐魚的研究主要集中在鮐魚貯藏保鮮以及品質變化、微生物菌群等方面。利用酶解-發酵并用的快速發酵技術，將鮐魚加工成營養豐富的海鮮調味品的研究罕見報道，同時也為快速發酵技術提供一定的參考價值。

因此，本文以鮐魚為原料，優化了酶解-發酵法制備魚鮮汁的工藝，改善了產品風味，并對產品的品質進行分析，在一定程度上可提高鮐魚的加工價值，以期為鮐魚的綜合利用及海鮮調味品的開發提供思路和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮐魚 浙江寧波路林市場，清洗取肉，攪拌成魚糜待用；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶、丹磺酰氯 北京索萊寶科技有限公司；米曲霉滬釀3.042 上海佳民釀造食品有限公司；混合氨基酸標準溶液 日本和光純藥工業株式會社；乙腈 色譜純，美國Fisher公司；甲醛、磺基水楊酸等試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

5804R高速冷凍離心機 德國艾本德公司；RXZ型智能恒溫培養箱 寧波江南儀器廠；KDN-102C型凱氏定氮儀 浙江托普儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；Waters e2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝優化

1.2.1.1 蛋白酶的篩選 分別考察中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶和風味蛋白酶對魚糜的酶解效果，酶添加量1000 U/g（w/w），固液比1:5（魚糜:0.2 mol/L的磷酸緩沖液，w/v），酶解時間6 h，酶解溫度及緩沖液pH選擇如下：中性蛋白酶（50 ℃、pH7.0）、酸性蛋白酶（50 ℃、pH3.0）、木瓜蛋白酶（45 ℃、pH6.5）、復合蛋白酶（50 ℃、pH6.5）和風味蛋白酶（50 ℃、pH7.0）。酶解后滅酶（95 ℃、15 min），冷卻后，定容至100 mL，離心取上清液（8000 r/min、15 min），測定水解度（degree of hydrolysis，DH，%）。

1.2.1.2 酶解時間對酶解效果的影響 稱取一定量魚糜，酶添加量1000 U/g（w/w），固液比為1:5（w/v、pH7.0），酶解溫度為50 ℃，考察不同酶解時間（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h）對水解度的影響。

1.2.1.3 酶添加量對酶解效果的影響 稱取一定量魚糜，固液比為1:5（w/v、pH7.0），酶解溫度為50 ℃，酶解時間為6 h，考察酶添加量（200、400、600、800、1000、1200、1400、1600 U/g，w/w）對水解度的影響。

1.2.1.4 固液比對酶解效果的影響 稱取一定量魚糜，酶添加量1000 U/g（w/w），酶解溫度為50 ℃，酶解時間為6 h，考察不同固液比（1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:10，w/v、pH7.0）對水解度的影響。

1.2.1.5 溫度對酶解效果的影響 稱取一定量魚糜，酶添加量1000 U/g（w/w），固液比為1:5（w/v、pH7.0），酶解時間為6 h，考察不同酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃）對水解度的影響。

1.2.1.6 兩種蛋白酶配比篩選 稱取一定量魚糜，固液比為1:5（w/v、pH7.0），酶解溫度為50 ℃，酶解時間為6 h，總添加量1000 U/g（w/w），考察中性蛋白酶和風味蛋白酶不同配比（1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、3:1、1:3、3:2、2:3，w/w）對水解度的影響。

1.2.1.7 正交試驗優化 根據試驗結果設計四因素三水平L9（34）正交試驗，具體見表1。正交試驗采用的酶為中性蛋白酶/風味蛋白酶（1:2，w/w）。

表1 L9（34）正交試驗因素水平設計Table 1 Factor and level setting table for L9(34) orthogonal test

1.2.1.8 水解度的測定 水解度（DH，%）=（水解液中氨基酸態氮含量/樣品總氮含量）×100，其中樣品總氮含量采用凱氏定氮法[13]；上清液中氨基酸態氮含量（也稱氨基氮含量）采用甲醛電位滴定法[14]。

1.2.2 稀醪發酵工藝優化

1.2.2.1 曲的制作 制作方法參考張杰等[15]的方法并略作調整，原料（豆粕:麩皮:水=4:2:5，w/w/w）浸泡5 h后，滅菌（121 ℃，40 min），冷卻至室溫，接入0.2%（米曲霉：原料，w/w）的米曲霉滬釀3.042，混合均勻，于35 ℃，濕度80%的條件下培養24 h，進行翻曲后繼續培養12 h，培養結束后將曲于4 ℃下冷藏備用。

1.2.2.2 稀醪發酵時間的確定 向酶解液中添加制備好的曲進行稀醪發酵，曲添加量10%（w/w），鹽添加量12%（w/w），還原糖（木糖:葡萄糖=1:4）添加量3%（w/w）,于35 ℃的生化培養箱中恒溫發酵，發酵期間每天攪拌3次，3 d取一次樣，測定其氨基酸態氮含量以及pH，以氨基酸態氮含量來確定發酵時間。

1.2.2.3 曲添加量對發酵效果的影響 還原糖（木糖:葡萄糖=1:4）添加量3%（w/w），鹽添加量12%（w/w），在35 ℃下恒溫發酵21 d，考察不同曲添加量（2、4、6、8、10、12、14%，w/w）對氨基酸態氮含量的影響。

1.2.2.4 鹽添加量對發酵效果的影響 還原糖（木糖:葡萄糖=1:4）添加量3%（w/w），曲添加量10%（w/w），在35 ℃下恒溫發酵21 d，考察不同鹽添加量（3、6、9、12、15、18、21、24%，w/w）對氨基酸態氮含量的影響。

1.2.2.5 溫度對發酵效果的影響 還原糖（木糖:葡萄糖=1:4）添加量3%（w/w），曲添加量10%（w/w），鹽添加量12%（w/w），發酵時間為21 d，考察不同發酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）對氨基酸態氮含量的影響。

1.2.2.6 正交試驗優化 根據試驗結果，設計三因素三水平L9（34）優化稀醪發酵參數，具體見表2。

表2 L9（34）正交試驗因素水平設計Table 2 Factor and level setting table for L9(34) orthogonal test

1.2.2.7 氨基酸態氮的測定 采用甲醛電位滴定法[14]對發酵液進行測定。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 基本理化指標檢測 采用凱氏定氮法測定總氮[13]；甲醛滴定法測定氨基酸態氮[14]；pH電位法測定總酸[16]；稱量法測定可溶性無鹽固形物[17]及滴定法測定含鹽量[17]等理化特性。

1.2.3.2 氨基酸測定 游離氨基酸樣品前處理參考張璟琳等[18]的方法并略作調整，取適量樣品和10%的磺基水楊酸溶液1:1（v/v）混勻，4 ℃靜置過夜，離心后取適量上清液，用0.02 mol/L鹽酸溶液稀釋40倍，過0.22 μm濾膜，待上機分析。色譜條件：分離柱（內填日立專用離子交換樹脂，4.6 mm ID×60 mm×3 μm），分離柱柱溫57 ℃，梯度洗脫，洗脫液流速0.35 mL/min，反應柱（內填金剛砂惰性材料，4.6 mm ID×40 mm）柱溫135 ℃，反應液茚三酮流速0.35 mL/min，檢測波長570 nm和440 nm，進樣量20 μL，每個樣品平行進樣3次，樣品分析周期為53 min。

1.2.3.3 生物胺測定 生物胺標準儲備溶液和標準混合使用液的配制參考文獻[19]臨用現配；生物胺混合標準系列溶液及樣品的衍生化參考周火蘭[20]的方法進行測定。自動進樣器以0.80 mL/min的流速通過柱溫為30 ℃的ChromCore C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。采用流動相A（超純水，0.1%乙酸）和B（乙腈，0.1%乙酸）進行梯度洗脫，洗脫梯度：0～2 min，45%A；2～27 min，45%～5%A；27～30 min，5%A；30～32 min，5%～45%A。

1.2.3.4 微生物檢測 采用平板計數法進行菌落總數的測定[21]；采用大腸菌群MPN計數法檢測大腸菌群[22]。

1.3 數據處理

每個試驗均平行測定3次，結果取平均值，所有數據均采用SPSS 21軟件分析，用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝的優化

2.1.1 酶解因素對酶解效果的影響 由圖1（a）可得，中性蛋白酶和風味蛋白酶的水解效果優于酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶，因此選擇中性蛋白酶和風味蛋白酶進行后續實驗。

由圖1（b）可知，隨著酶解時間的延長，這兩種酶的水解度都逐漸增加，但6 h之后，趨于平緩，因此適宜的酶解時間為6 h左右。在圖1（c）中，隨著酶添加量的增加，水解度也隨之增加，風味蛋白酶的增加幅度較大，當添加量大于600 U/g后，其水解效果好于中性蛋白酶，兩種蛋白酶的添加量均達到800 U/g之后，水解度趨于平緩；圖1（d）是固液比對水解效果的影響，隨著固液比的增加，水解度都逐漸降低，當固液比小于1:5時，水解度的增加幅度較平緩，因此固液比1:5為宜。圖1（e）是溫度對水解效果的影響，結果顯示，兩種蛋白酶的最適酶解溫度均為50 ℃。

中性蛋白酶屬內切酶，酶解液的苦味可能是中性蛋白酶酶解鮐魚蛋白時產生了疏水性的氨基酸所致。而風味蛋白酶是蛋白酶和肽酶的復合物，兼具內切和外切兩種功效，在脫除蛋白酶水解液的苦味、徹底水解蛋白質、增強風味等方面得到了廣泛的應用[23]。用中性蛋白酶與風味蛋白酶共同酶解以提高水解度并改善其風味，兩種酶的復合水解效果如圖1（f）所示，發現當中性蛋白酶:風味蛋白酶=1:2時（總添加量1000 U/g，w/w），水解效果最佳。

圖1 酶解因素對酶解效果的影響Fig.1 Influence of enzymolysis factors on the effect of enzymolysis

2.1.2 正交試驗優化 酶解工藝的正交試驗L9（34）結果見表3、表4。由表4可知，因素A的MS值小于誤差e的MSe，將因素A的MS歸入到誤差項，得到新的誤差e*，使得各因素的MS大于新誤差項的MSe，進行下一步分析。此外，經過F檢驗，發現固液比和溫度對水解度有顯著影響（P＜0.05），而酶解時間和酶添加量對水解度無顯著影響（P＞0.05）。由表3、表4可以得出，四個因素的主次關系為C＞B＞D＞A，最優酶解條件為A2B2C1D2，即固液比1:4（魚糜:0.2 mol/L的磷酸緩沖液，w/v、pH7.0），酶添加量800 U/g（w/w），酶解溫度為50 ℃以及酶解時間為6 h，該條件下，水解度為69.67%±0.47%，酶解液呈淡黃色，有魚香味，無不良氣味，可用作稀醪發酵的原料，進行后續實驗。

表3 酶解正交試驗設計和結果Table 3 Enzymatic hydrolysis orthogonal test design and results

表4 酶解正交試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of the results of enzymatic hydrolysis orthogonal test

2.2 稀醪發酵工藝的優化

2.2.1 稀醪發酵因素對發酵效果的影響 由圖2（a）可得，隨著發酵時間的增加，氨基酸態氮含量持續增加，21 d時達到最高，隨后開始下降，表明發酵已經基本完成，因此后續試驗采用21 d作為發酵周期。發酵初期，發酵液的pH逐漸下降，12 d時達到最低，之后回升，逐漸趨于穩定。pH逐漸降低，可能是由于蛋白質降解為氨基酸和多肽，還有其它一些酸性代謝產物，如乳酸等[24]；pH回升可能是發酵中后期，營養物質被消耗完，菌體自溶所引起的，但還是在5.0～6.0的標準范圍內。

圖2 （b）是曲添加量對發酵效果的影響，隨著曲添加量的增加，氨基酸態氮含量也持續上升，到10%之后趨于平緩，可能是微生物分泌的酶和底物比例達到飽和，因此適合的曲添加量為10%左右。圖2（c）是鹽添加量對發酵效果的影響，發酵幾天后，發現含鹽量3%（2 d）和6%（5 d）的試驗組出現了腐敗現象。可能是由于鹽度太低，微生物利用發酵液中豐富的營養物質大量繁殖，導致樣品腐敗[25]，因此將上述兩組數據棄用。鹽添加量為12%時，氨基酸態氮含量最高；添加量大于12%時，氨基酸態氮含量逐漸降低。從圖2（d）可以看出，隨著溫度的增加，氨基酸含量先增加再降低，其中發酵溫度為35 ℃時，氨基酸態氮含量最高。發酵溫度過低過高都會抑制微生物的生長繁殖，特別是低溫發酵，由于腐敗微生物繁殖比較快，會促使醬醅呈現酸性，導致產品的魚腥味偏高[26]，且口感偏苦。

圖2 稀醪發酵因素對發酵效果的影響Fig.2 Influence of the fermentation factors of thin mash on the fermentation effect

2.2.2 正交試驗優化 稀醪發酵工藝的正交試驗L9（34），結果見表5、表6。

由表6可得，各因素的MS大于誤差項的MSe，可進行下一步分析。此外，經過F檢驗，發現鹽添加量和曲添加量對氨基酸態氮有顯著影響（P＜0.05）,而發酵溫度對其無顯著影響（P＞0.05）。

由表5、表6可以得出，三個因素的主次關系為B＞C＞A，最優發酵條件為A2B1C3，即鹽添加量9%（w/w），曲添加量14%（w/w），發酵溫度為40 ℃，該條件下所得的發酵液氨基酸態氮含量達0.81±0.02 g/100 mL。發酵液呈紅褐色，顏色均一，有光澤，無懸浮物和沉淀物；醬香味較濃，具有魚味調味品固有香氣及味道，無異味和臭味等不良氣味；味道鮮美，咸味適口，入口滑爽。

表5 稀醪發酵正交試驗設計和結果Table 5 Orthogonal test design and results of thin mash fermentation

表6 稀醪發酵正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test results of thin mash fermentation

2.3 指標檢測

2.3.1 理化指標檢測和微生物檢測 氨基酸態氮含量是決定調味品質量好壞的關鍵，含量越高，營養價值就越高；總氮以及總酸均是影響其滋味和口感的重要因素；調味品的pH標準范圍為5.0～6.0，發酵液的pH為5.08；發酵液采用低鹽速釀方式制得，鹽添加量為9%，測得發酵液鹽含量為8.65 g/100 mL。發酵液的理化指標檢測結果具體見表7，根據發酵液的感官評價和理化指標，可達二級低鹽固態釀造醬油（GB/T 18186-2000）要求[17]。發酵液的微生物檢測結果具體見表8，發酵液中菌落總數和大腸菌群均符合醬油中（GB 2717-2018）微生物限量要求[27]，說明發酵液符合衛生要求。

表7 理化指標檢測結果Table 7 Test results of physical and chemical indicators

表8 微生物檢測結果Table 8 Results of microbiological testing

2.3.2 氨基酸分析 氨基酸是蛋白質的降解產物，魚露中的鮮味氨基酸、甜昧氨基酸和苦味氨基酸的組成變化對魚露的主體風味有著重要的影響[28]，是評價海鮮調味品營養價值的重要指標。為表征魚肉蛋白的降解情況，對本發酵液中的游離氨基酸組成及含量進行了分析，結果見圖3。

圖3 魚鮮汁的氨基酸分析Fig.3 Amino acid analysis of fish juice

發酵液中共檢測到17種氨基酸，其中Asp和Glu為鮮味氨基酸；Ser、Gly、Ala、Thr和Pro為甜味氨基酸；Val、Met、Ile、Leu、Arg、Phe、His為苦味氨基酸；Tyr、Lys、Cys為無味氨基酸，除了這3種氨基酸，其余氨基酸均為呈味氨基酸，占比87.24%。且Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe和Lys是必需氨基酸。本發酵液是通過加酶和加曲的方法，加速蛋白分解從而大大縮短了發酵周期，同時降低了產品的含鹽量，這跟李銳等[29]得到的結果相似。其中，鮮味氨基酸Asp和Glu，占比27.20%，因此該發酵液鮮味明顯。同時，柔和的甜味也豐富了發酵液的味道，雖然苦味氨基酸含量較高，占比37.24%，但發酵液中鮮甜味氨基酸占比約是苦味氨基酸的2倍，使得發酵液基本感受不到明顯的苦味，因此低鹽速釀并沒有使得魚鮮汁的風味很差；其中苦味氨基酸如Arg等低濃度時還能促進鮮味和甜味的的協同作用。在營養方面，魚鮮汁中必需氨基酸占比44.95%，明顯高于WHO/FAO的標準（35.38%），必需氨基酸利于人體吸收利用，含量越高，營養價值越高，表明經酶解-發酵制備的魚鮮汁具有較高的營養價值。

2.3.3 生物胺分析 生物胺是一種低分子量、不揮發的有機化合物，其衍生自氨基酸的微生物脫羧作用或源自醛和酮的胺化和轉氨作用[30]。生物胺的存在及含量多少可以指示判斷食物的變質和海鮮調味品的安全水平，是表征其品質的重要指標。

表9 表示魚鮮汁中生物胺的含量，檢測發現精胺含量低于0.01 mg/100 mL，因此忽略不計。其中，色胺含量最高，達21.17 mg/L，這是因為發酵過程中有效控制了微生物的生長繁殖，使得生物胺的含量都比較低。而組胺是海鮮調味品中毒性最大的生物胺，研究發現，從食物中過量攝入，會引起毒性作用[31]，因此美國要求水產品和食品中組胺的含量不得超過50 mg/kg[31]；我國規定鮐魚中組胺含量不得超過1000 mg/kg，其他海產魚類中不超過300 mg/kg，該發酵液中組胺含量僅為13.35 mg/L。酪胺對人體血管和神經系統有直接或間接的影響。其他生物胺，如腐胺，雖然不構成直接風險，但會刺激組胺和酪胺的毒理學效應，對人體健康造成負面影響。其中加拿大魚油檢驗局所允許的魚露中最大苯乙胺含量為30 mg/kg[31]，最大酪胺含量為100 mg/kg[31]。但其他生物胺在魚露、醬油或其它調味品中還沒有作出明確的限量標準，需進一步研究。發酵液采用低鹽恒溫速釀，發酵周期縮短的同時，也減緩了生物胺的生成和累積，使其生物胺（組胺、苯乙胺和酪胺）的含量符合國內外各個限量標準，具有良好的營養安全性。

3 結論

本文采用中性蛋白酶/風味蛋白酶（1:2，w/w）對鮐魚進行酶解，在最佳酶解工藝的基礎上，加曲恒溫發酵21 d，所得發酵液呈紅褐色，具有魚味調味品固有香氣及味道，氨基酸態氮含量達0.81±0.02 g/100 mL。

發酵液中鮮甜味氨基酸占比50.00%、必需氨基酸占比44.95%，使得發酵液鮮味明顯、營養價值較高；且生物胺含量符合限量標準，組胺含量僅為13.35 mg/L。因此，發酵液具有較高的營養價值和較好的營養安全性，可作為調配魚露或其它海鮮調味品的基料，為鮐魚的加工利用提供一條新的途徑，對以其他品種的低值水產品為原料開展魚露的速釀生產亦具有借鑒意義，具有較好的開發前景和市場預期。