猴頭菇三萜提取工藝優化及其抗氧化活性分析

李英迪，曹 艷，夏其樂, ，楊 開，毛榮良

（1.浙江省農業科學院 食品科學研究所，農業農村部果品采后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江杭州 310021；2.浙江工業大學食品科學與工程學院，浙江杭州 310014；3.常山縣豪鋒農業發展有限公司，浙江常山 324207）

猴頭菇，又名猴頭菌、刺猬菌等，屬擔子菌門、齒菌科、猴頭屬，是藥食兩用真菌和野生美味佳肴，是中國著名的四道菜之一[1-2]。猴頭菇中含多糖類、甾醇類、萜類、酚類等活性成分，具有抗氧化、降血脂、增強免疫力、抗癌、抗腫瘤、延緩衰老等功效[3-5]。石鳳敏等[6]指出可以通過多糖和三萜類化合物的含量評價靈芝藥用價值和品質。萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生而成的天然產物，由多個異戊二烯結構單位構成，其中三萜類固醇和皂苷在細胞質中利用甲羥戊酸途徑中的IPP合成[7-8]，是一類重要的次級代謝產物，除了具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖等功能外，還具有其他活性，如免疫調節、抗氧化、抗衰老、神經保護等生物學和藥理學作用，具有廣闊的開發應用前景[7,9]。Bourgou等[10]從精油中分離出四種萜類化合物，通過氧自由基吸收能力評估萜類化合物的生物活性，發現其在體外均表現出抗氧化活性。凡蕓等[11]以杏鮑菇為原料，采用超聲輔助法提取三萜化合物，最佳條件為：乙醇體積分數70%、料液比1:30 g·mL-1、超聲時間25 min、提取溫度60 ℃，在此條件下，杏鮑菇中總三萜化合物的提取率達到1.140%。鄧春萌等[12]研究牛樟芝固態發酵菌絲體中三萜的最佳提取工藝條件為：浸提時間3 h、料液比1:30（g·mL-1）、溫度70 ℃，在此條件下，得率為3.43%。楊開等[13]對牛樟芝總三萜超聲輔助提取的最佳工藝條件為：提取時間41 min、提取功率80 W、料液比1:20，總三萜得率為3.84%±0.18%。牛樟芝三萜提取物具有較強的還原能力，并能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基，其半清除濃度（EC50）分別為0.29、0.50、0.33 mg·mL-1。鄒思等[14]采用回流提取法提取虎奶菇菌核總三萜最佳工藝參數為:乙醇濃度95%、提取時間2 h、提取溫度90 ℃、料液比1:15（ g·mL-1），提取率為（2.29±0.06）mg·g-1。菌核醇提物對羥自由基、DPPH自由基清除活性和ABTS自由基的清除能力半數抑制濃度（IC50）分別為（0.425±0.01）、（3.25±0.05）和（18.35±2.32）mg·mL-1，其表現出較強的羥自由基和良好的DPPH自由基清除活性，對ABTS自由基的清除能力相對較弱。萜類化合物具有非常好的應用前景，目前還沒有關于猴頭菇三萜類的研究。

本文以猴頭菇為原料，利用響應面法優化猴頭菇三萜提取工藝，以三萜得率為評價指標,并初步探索猴頭菇三萜的體外抗氧化活性，以期為開發天然抗氧化劑和功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇 常山縣豪鋒農業發展有限公司提供干制品；1, 1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2, 2'-氨基-雙（3-乙基苯并噻唑膠-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、鐵氰化鉀 均購自上海源葉；乙醇、香草醛、冰乙酸、三氯乙酸、三氯化鐵、高氯酸 均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司。

UV-1800紫外/可見分光光度儀 日本島津公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；R1002B旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；LXJ-HB飛鴿低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；BJ-300多功能粉碎機 德清拜杰電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將猴頭菇干制品粉碎機粉碎，過100目篩，密封后置于4 ℃冷藏，備用。

1.2.2 三萜提取響應面實驗 在前期預實驗的基礎上，進行提取工藝的優化。稱取一定量的猴頭菇干粉，按照不同料液比（1:10、1:20、1:30 g·mL-1）和乙醇濃度（40%、60%、80%）進行超聲輔助（40、60、80 ℃）提取30 min（保鮮膜覆蓋，防止揮發）。所得提取液4000 r·min-1離心10 min，收集上清液，即猴頭菇三萜提取液。將所得上清液旋蒸濃縮，冷凍干燥得提取物粉末。

采用Design Expert 10.0.3軟件進行三因素三水平試驗確定超聲輔助（功率500 W，頻率40 kHz，30 min）提取猴頭菇三萜的最佳工藝參數，中心組合試驗因素和水平見表1。

表1 猴頭菇三萜提取試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of extraction experiment triterpenoids from Hericium erinaceus

1.2.3 猴頭菇三萜含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 參照王豪等[15]方法，三萜測定以齊墩果酸為標準品，依次吸取0.2 mg·mL-1齊墩果酸標準品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL比色管中，氮吹儀吹干溶劑，加入0.5 mL 50 g·L-1的香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，混合后60 ℃水浴20 min，冰水冷卻15 min后加入3.0 mL冰乙酸，室溫反應10 min，最后于547 nm處測吸光值，以齊墩果酸標準品濃度W（mg·L-1）為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制三萜含量標準曲線，并得線性回歸方程。

1.2.3.2 三萜得率的計算 取150 μL提取液，用氮吹儀吹干樣品，按1.2.3.1標曲操作測定樣品濃度。根據標曲方程計算樣品三萜含量。三萜得率可根據公式計算：

式中：M表示猴頭菇三萜得率（%）；C表示齊墩果酸濃度（mg·mL-1）；V表示提取液的總體積（mL）；N表示稀釋倍數；m表示猴頭菇質量（g）。

1.2.4 抗氧化實驗 抗氧化實驗測定時，用60%乙醇將猴頭菇三萜提取物配制成0.1～2.5 mg·mL-1濃度的樣品待測液。

1.2.4.1 DPPH·清除能力測定 將猴頭菇三萜提取液旋蒸濃縮并冷凍干燥成粉末，加60%乙醇配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1濃度的樣品待測液。參照杜麗娟等[16]方法，并據實驗情況稍作修改。取各濃度樣品溶液0.8 mL，加入3.8 mL濃度為0.1 mmol·L-1的DPPH 溶液（無水乙醇配制），搖勻后黑暗放置30 min，并于517 nm處測吸光值。VC為陽性對照，計算DPPH·清除率公式如下：

式中：Ax為不同濃度樣品溶液的吸光值；Ax0為0.8 mL不同濃度樣品溶液和3.2 mL無水乙醇的吸光值；A0為0.8 mL蒸餾水和3.2 mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 還原力測定 將猴頭菇三萜提取液旋蒸濃縮并冷凍干燥成粉末，加60%乙醇配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1濃度的樣品待測液。參照林源等[17]方法，并據實驗情況稍作修改。取各濃度樣品溶液2.0 mL，加入2.0 mL濃度為0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻后于50 ℃水浴20 min，再加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液后離心（3000 r·min-1，5 min），取2.0 mL上清液，加入2.0 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1%FeCl3溶液混勻，50 ℃水浴10 min后在700 nm處測吸光值。蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，VC為陽性對照。

1.2.4.3 ABTS+·清除能力測定 將猴頭菇三萜提取液旋蒸濃縮并冷凍干燥成粉末，加60%乙醇配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1濃度的樣品待測液。參照吳美媛等[1]方法，并據實驗情況稍作修改。將7 mmol·L-1ABTS+·溶液與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液等量混合反應，室溫避光放置12～16 h得到ABTS+·儲備液。在734 nm波長處，用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH7.4）將ABTS+·儲備液稀釋至吸光值達到0.70±0.02，得到ABTS+·測定液。取各濃度樣品溶液1.0 mL與2.0 mL上述ABTS+·測定液混合均勻，室溫避光反應6 min后于734 nm波長處測定吸光值。VC為陽性對照，計算ABTS+·清除率公式如下：

式中：Ai為不同濃度樣品溶液的吸光值；Aj為不同濃度樣品溶液和磷酸鹽緩沖液的吸光值；A0為蒸餾水和ABTS+·測定液的吸光值。

1.3 數據處理

平行實驗3次，結果以均值±標準差（means±SD）表示，數據采用SAS 8.1進行顯著性分析，使用Microsoft Excel繪圖，Design Expert 10.0.3軟件得到響應面圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據1.2.3.1標曲測定方法，分別以齊墩果酸標準品濃度為橫坐標，547 nm處吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：y=0.0349x+0.0018，R2=0.9907。結果表明三萜含量在0～25 mg·L-1范圍內線性關系良好。標準曲線如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標準曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 響應面優化結果

乙醇濃度、溫度和料液比對三萜提取均有影響，為探究各因素之間的相互作用，確定最優條件，由Box-Behnken法設計試驗[18]，有5個試驗中心點，共17個試驗點，以三萜得率為響應值，響應面法對猴頭菇三萜類化合物提取工藝優化的試驗方案及真實值如表2所示。與傳統的多因素單變量優化實驗相比，響應曲面法可以研究各因素之間的相互作用，具有試驗次數少、省時省力、精確等優點[19]。

對表2實驗數據進行回歸擬合，得到三萜得率的二次多項回歸模型為：

表2 猴頭菇三萜類化合物提取試驗設計與試驗結果Table 2 Experimental design and results of triterpenoid extracts from Hericium erinaceus

其中，Y代表三萜得率的預測響應值，X1代表乙醇濃度（%）的編碼值，X2代表溫度（℃）的編碼值，X3代表料液比（g/mL）的編碼值。

對試驗結果進行方差分析結果見表3，回歸模型具有較高的F值（150.87）和極低的P值（＜0.0001），表明該模型是高度顯著的。復決定系數R2=0.9949，表明料液比、乙醇濃度和提取溫度存在良好線性關系，模型誤差小、擬合度較高。決定系數R2Adj為0.9883，說明該模型可信度較高，能夠解釋98.83%的響應值變化。信噪比Adeq Precision為38.837＞4，表明方程的擬合度和可信度極高，可用此模型對猴頭菇三萜類化合物提取的影響因素進行可靠分析和預測。由表3各因素F值可知，各個因素對三萜類化合得率的影響程度為乙醇濃度（X1）＞溫度（X2）＞料液比（X3）。

表3 三萜類化合物回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model of triterpenes

2.3 三萜提取工藝的響應曲面分析、最佳工藝參數確定

Design Expert 10.0.3軟件得到響應面圖（圖2～圖4）顯示了不同試驗因素（乙醇濃度、溫度以及料液比）對猴頭菇三萜類化合物提取的影響。由圖2～圖4可以看出各因素及其相互作用的影響，在試驗水平范圍內出現了一個最高點，即為三萜得率較高點，響應面圖所示最大響應值與回歸方程所得結果一致。黑育榮等[20]對樺菌芝三萜最佳提取工藝參數為:乙醇濃度70%，超聲溫度70 ℃，時間15 min，料液比1:15，提取率為3.87 mg·g-1。溫慧萍等[21]對靈芝孢子粉三萜最佳提取條件:乙醇濃度80%，固液比1:23，超聲功率540 W，提取溫度40 ℃，提取時間15 min，提取率7.054 mg·g-1。由于原材料不同，最優提取條件下的得率也會有所差別。由Design Expert 10.0.3軟件分析結果可知，猴頭菇三萜類化合物超聲波輔助提取的最佳工藝參數為：乙醇濃度58.57%，溫度57.25 ℃，料液比1:14.61（g:mL）。工藝參數預測的三萜得率為0.28%。為了操作方便，將最佳工藝參數設定為乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1:15（g:mL）。為檢驗響應面分析法可靠性，采用上述最優條件3次重復試驗得率為0.28%，與預測值較為接近，表明該模型對猴頭菇三萜類化合物的提取工藝參數準確可靠，具有實際應用價值。

圖2 提取溫度與料液比對猴頭菇三萜得率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface graph and contour plot of the effect of extraction temperature and material-liquid ratio on the yield of Hericium erinaceus triterpenes

圖3 乙醇濃度與料液比對猴頭菇三萜得率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface graph and contour plot of the effect of ethanol concentration and material-liquid ratio on the yield of Hericium erinaceus triterpenes

圖4 乙醇濃度與提取溫度對猴頭菇三萜得率影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface graph and contour plots of the effect of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of Hericium erinaceus triterpenes

2.4 猴頭菇三萜抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除能力 如圖5所示，當提取物濃度在0.5～2.5 mg·mL-1范圍時，隨著提取物濃度的增加對DPPH·清除率逐漸增加，提取物濃度與DPPH·清除率呈正相關量效關系。在質量濃度為2.5 mg·mL-1時，對DPPH·清除率為25.4%，清除率相對較低。帥良等[22]研究百香果果皮多糖對DPPH·清除能力時，也發現其清除率相對較低，質量濃度為2.0 mg·mL-1時，清除率為32.8%。而VC質量濃度在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內增加顯著，超過0.03 mg·mL-1時，對DPPH·清除率趨于平緩，0.05 mg·mL-1時達到95.2%。由圖5可知，猴頭菇三萜對DPPH·具有一定的清除能力，其中，IC50值（6.375±0.020） mg·mL-1明顯高于VC的IC50值（0.0194±0.0060） mg·mL-1，說明猴頭菇三萜抗氧化能力相比VC較弱，這與張意笠等[23]研究結香花總黃酮對DPPH·清除率弱于VC的結果一致。

圖5 猴頭菇三萜對DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of Hericium erinaceus triterpenes

2.4.2 還原能力 樣品的抗氧化能力與還原性有關，還原力越強，抗氧化能力越強。由圖6可知，樣品濃度為0.5～2.5 mg·mL-1時，提取物還原能力隨樣品濃度的增加呈明顯的量效關系，測得700 nm處的吸光值由0.107增加到0.553。其中，2.5 mg·mL-1提取物還原力與0.05 mg·mL-1的VC相當，雖然提取物還原力較VC弱，但也表現出一定的還原能力。

圖6 猴頭菇三萜還原能力Fig.6 Reducing power of Hericium erinaceus triterpenes

2.4.3 ABTS+·清除能力 如圖7所示，當提取物濃度在0.1～0.5 mg·mL-1范圍時，對ABTS+·清除率隨著提取物濃度的增加而增加，具有良好的線性關系和劑量關系。當濃度達到0.5 mg·mL-1時，對ABTS+·清除率達到64.4%，其IC50值為（0.355±0.040）mg·mL-1，表明猴頭菇三萜對ABTS+·具有良好的清除作用。結合參考文獻[24]及前期實驗濃度VC濃度在0.01～0.05 mg·mL-1范圍時，對ABTS+·清除率穩定在97%左右，由此可見，猴頭菇三萜與VC相比對ABTS+·清除能力較弱。分 的 分 離 與 鑒 定[J]. 食 品 工 業 科 技，2019，40（21）：32-37.［ZHOU C H, HUANG Y, LIU T T, et al. Isolation and identification of the components of the fractions in ethyl acetate phase from ethanol extract ofHericium erinaceus[J]. Food Industry Technology，2019，40（21）：32-37.］

圖7 猴頭菇三萜對ABTS+·清除率Fig.7 ABTS+· scavenging rate of Hericium erinaceus triterpenes

3 結論

本研究通過Box-Behnken試驗設計結合響應面法優化猴頭菇三萜提取的影響因素乙醇濃度、提取溫度、料液比，最終確定最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1:15（g:mL），三萜得率相對較高，為0.28%，與預測值接近，說明響應曲面法準確可靠，能合理優化猴頭菇三萜的提取工藝，為進一步開發利用提供理論參考。以DPPH·自由基清除率、還原力、ABTS+·自由基清除率為指標測定抗氧化活性，DPPH和ABTS+的IC50值分別為（6.375±0.020）和（0.355±0.040） mg·mL-1，說明猴頭菇三萜具有一定的抗氧化性。